论文部分内容阅读
研究背景卵巢癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一,其中发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌,占妇科恶性肿瘤的第三位,目前其治疗手段主要是手术和化疗,但长期以来其5年存活率始终停留在30%,死亡率已居女性生殖系统肿瘤的首位。因此非常迫切的需要寻找到新的有效的抗癌药物。吴茱萸碱是中药吴茱萸主要生物活性成分之一,已有报道吴茱萸碱有血管舒张,抗炎及镇痛等作用。另外吴茱萸碱体外能明显抑制人前列腺癌细胞LNCaP、 PC-3、人黑色素瘤细胞A375-S2、人白血病细胞U937、人宫颈癌Hela细胞的生长。然而吴茱萸碱对卵巢癌细胞的作用和作用机制均不明确。实验目的研究吴茱萸碱对人高转移卵巢癌细胞HO-8910PM增殖、周期、凋亡和转移的影响,并初步探讨其作用机制。实验方法1.用MTT法检测吴茱萸碱在不同时间点对人高转移卵巢癌细胞HO-8910PM体外增殖的影响；2.用流式细胞术(FCM)检测经吴茱萸碱处理后HO-8910PM细胞的细胞周期变化；3.用AnnexinV/PI双染法检测吴茱萸碱诱导细胞凋亡的发生；4.应用Transwell体外侵袭和迁移模型检测吴茱萸碱对细胞迁移和侵袭的抑制作用;5.用western blot方法分析周期、凋亡及转移相关蛋白的变化。实验结果1.吴茱萸碱可以明显抑制卵巢癌细胞的增殖,且呈时间依赖性和浓度依赖性。与空白对照组比较,0.625μM～10μM吴茱萸碱作用24h后,HO-8910PM细胞的生长抑制并不明显。但在作用48h、72h和96h后,增殖抑制率非常显著,其抑制作用呈现剂量依赖性和时间依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.吴茱萸碱将卵巢癌细胞阻滞于G2/M期。流式细胞分析术结果显示,吴茱萸碱作用于HO-8910PM细胞24h后,各浓度组(OμM,1.25μM,2.5μM和5μM)各周期内的细胞数量发生明显变化,随着药物浓度的增加,G0/G1期细胞明显减少而G2/M期细胞逐渐增加,其差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot实验显示吴茱萸碱作用24h后,CyclinB1蛋白表达水平明显上升。3.吴茱萸碱可以通过外源性死亡受体凋亡通路和内源性线粒体凋亡通路诱导卵巢癌细胞凋亡。流式细胞分析术结果显示,吴茱萸碱各浓度组(1.25μM,2.5μM和5μM)作用于HO-8910PM细胞48h后,凋亡细胞显著增加,且具有药物浓度依赖性。Western Blot实验显示吴茱萸碱作用24h后,HO-8910PM细胞中Cleaved Caspase-3、8、9及bax表达量明显上升,而Bcl-2表达量明显下降。4.吴茱萸碱能抑制卵巢癌细胞侵袭和迁移能力。体外迁移能力检测结果显示,吴茱萸碱作用于HO-8910PM细胞12h后,各浓度组(0.625μM,1.25μM和2.51μM)细胞迁移至下室的细胞数量较对照组明显减少(P<0.05),并呈剂量依赖性。体外侵袭能力检测结果显示,吴茱萸碱作用于HO-8910PM细胞24h后,各浓度组(0.625μM,1.25μM和2.5μM)穿膜细胞数较对照组有明显减少(P<0.05),并呈剂量依赖性。Western Blot实验显示吴茱萸碱显著抑制了HO-8910PM细胞总FAK和p-FAK表达(P<0.05),同时吴茱萸碱可抑制MMP-2表达(P<0.05),但对MMP-9无显著影响(P>0.05)。5.吴茱萸碱可能通过PI3K/Akt和MAPKs信号通路影响卵巢癌细胞的增殖,生长和转移。Western Blot实验显示吴茱萸碱显著抑制HO-8910PM细胞PI3K, p-PI3K, Akt,p-Akt, ERK1/2MAPK, p38MAPK蛋白表达。结论吴茱萸碱能通过诱导细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡而抑制卵巢癌细胞的增殖,同时吴茱萸碱还能抑制细胞的迁移和侵袭,这些作用可能与PI3K/Akt、 ERK1/2MAPK和p38MAPK有关。