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本实验室体内研究曾表明,马尾松硫酸酯化多糖(SPPM60)能抑制HepG2细胞增殖,并诱导HepG2细胞分化,逆转其恶性,而PPM60无明显作用。本次实验拟以人白血病细胞株K562细胞为研究对象,考察PPM60或SPPM60对其生长状态的影响并对其机理进行初步探讨,以期为马尾松花粉多糖的开发利用提供理论支持,并为白血病的防治提供一种潜在的方法。实验主要分为以下几个部分:一、PPM60的分离纯化及硫酸酯化修饰:采用氯磺酸-吡啶法分别对50mg PPM60-A、PPM60-B、PPM60-C、PPM60-D进行硫酸酯化改性,得到暗黄色产物SPPM60-A、SPPM60-B、SPPM60-C、SPPM60-D61.8mg、79.0mg、63.2mg、71.9mg。用氯化钡-明胶比浊法鉴定其硫酸根含量并计算取代度分别为1.28、1.63、1.31、1.49。二、PPM60硫酸酯化前后对K562细胞增殖能力及细胞周期的影响:MTT法检测发现PPM60对K562细胞的增殖的抑制作用明显强于SPPM60,400μg/mLPPM60或SPPM60作用K562细胞48h时抑制率分别约达到32%和16%。瑞氏染色、Ho.33342/PI荧光双染观察PPM60或SPPM60对K562细胞形态的影响。经400μg/mLPPM60作用48h后,细胞体积缩小,核直径减小,核染色质浓缩,胞质丰富,核浆比例降低,细胞膜完整但不光滑,并出现一定程度的凋亡;SPPM60组与对照组相比没有明显差别。流式细胞技术检测PPM60或SPPM60处理前后K562细胞周期分布的变化。PPM60组较对照组G0/G1期细胞比例显著性增加,细胞周期发生了G0/G1期阻滞,并诱导凋亡发生。SPPM60处理组细胞细胞周期各个时相以及凋亡率与对照组相比,均没有显著性差异。三、PPM60硫酸酯化前后对K562细胞[Ca2+]i和活性氧的影响:分别以Fura-2/AM和DCFH/DA为探针,荧光分光光度计检测PPM60或SPPM60处理前后[Ca2+]i和胞内ROS的变化。PPM60作用24h、48h、72h后,PPM60组[Ca2+]i与对照组相比均明显上升,SPPM60组[Ca2+]i与对照组各时间点均显著性降低;PPM60组胞内ROS水平明显升高,SPPM60组胞内ROS水平与对照组相比基本没有变化。黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力法检测PPM60或SPPM60处理前后胞内SOD水平的变化。72h内K562细胞PPM60作用组的SOD活力较对照组有下降趋势;而SPPM60组胞内SOD活力与对照组相比,基本没有变化。TBA法检测PPM60或SPPM60处理前后胞内丙二醛(MDA)水平的变化。12h、24h、48h、72h后,PPM60组细胞内MDA与对照组相比都有所增加,SPPM60组胞内MDA水平高于对照组,但幅度甚小。以上结果表明:(1)PPM60对K562细胞有较强的抑制作用,硫酸酯化修饰之后降低了其抑制作用。(2)PPM60抑制K562细胞的机制可能是升高细胞内钙离子和活性氧浓度,阻滞细胞周期于G0/G1期,并诱导K562细胞产生凋亡。