论文部分内容阅读
随着社会的不断发展与进步,环境污染的危害性逐渐显现,威胁到人类的生命健康。多氯联苯(polychlorinated biphenyls,PCBs),是斯德哥尔摩公约中首批优先控制的12类有机污染物之一,对儿童神经系统及视网膜的发育有严重不良影响。本课题组前期的研究结果表明多氯联苯暴露可导致大鼠视网膜神经节细胞株(retinal ganglion cell-5,RGC-5)功能异常,并可导致幼年期斑马鱼视动反应敏感性降低。microRNA-182(miR-182),在小鼠的眼组织中首先被发现,在啮齿类动物、斑马鱼及人类的视网膜中特异性表达,对视网膜的发育及功能完善可能具有重要的调控作用,其表达异常会导致视网膜发育及功能异常。本研究拟探讨miR-182在多氯联苯暴露致视网膜神经节细胞功能异常中的作用机制。本研究选用大鼠视网膜神经节细胞RGC-5细胞株作为工具细胞,PCB1254作为染毒制剂,首先通过检测PCB1254暴露后RGC-5细胞内miR-182的表达变化、抑制miR-182表达对RGC-5细胞功能的影响以及过表达miR-182对PCB1254暴露后RGC-5细胞功能的影响来说明miR-182表达抑制是PCB1254引起RGC-5细胞功能异常的重要原因。然后,通过①检测PCB1254暴露后RGC-5细胞内FGF9(fibroblast growth factor 9)的表达变化以及MAPK/ERK信号通路中ERK1/2蛋白磷酸化水平的变化;②检测上/下调miR-182表达后RGC-5细胞内FGF9、ERK1/2蛋白磷酸化水平的变化的表达变化以及在293T细胞内构建双荧光素酶报告系统来说明FGF9是miR-182的作用靶基因;③检测过表达FGF9对RGC-5细胞功能的影响以及细胞内ERK1/2蛋白磷酸化水平的变化;④检测下调FGF9表达对PCB1254暴露后RGC-5细胞功能的影响以及细胞内ERK1/2蛋白磷酸化水平的变化,来明确miR-182通过与靶基因FGF9结合,进一步激活其下游的MAPK/ERK信号通路来参与多氯联苯影响视网膜神经节细胞功能的损伤过程,为临床研究多氯联苯对人类视网膜发育及视觉功能的影响提供依据。第一部分miR-182在PCB1254暴露后视网膜神经节细胞内的表达及其对视网膜神经节细胞功能的影响目的:研究miR-182在多氯联苯(PCB1254)暴露影响视网膜神经节细胞功能中的作用。方法:1.分别配置浓度为 0.125、0.25、0.5、1.0 mg/L 的 PCB1254对 RGC-5细胞进行暴露处理,并设立空白对照及0.01%甲醇对照组,测定细胞内miR-182表达水平。2.利用miR-182 inhibitor(miR-182抑制剂)转染RGC-5细胞,使miR-182下调,分别检测细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡功能变化。3.使用0.5、1.0 mg/L 的 PCB1254 刺激 RGC-5 细胞,再转染 miR-182 mimics(miR-182 类似物),分别检测细胞增殖、细胞凋亡功能变化。结果:1.随着PCB1254浓度的增高,RGC-5细胞内miR-182的表达逐渐被抑制,当浓度(?)0.5 mg/L时,与对照组的差异有统计学意义(P<0.05)。2.抑制miR-182表达对RGC-5细胞周期无显著影响(P>0.05),但可导致RGC-5细胞增殖能力降低(P<0.01),细胞内Caspase-3活性增高(P<0.05),表明抑制miR-182表达可抑制RGC-5细胞增殖、促进细胞凋亡。3.使用miR-182 mimics干预0.5、1.0 mg/L PCB1254暴露后的RGC-5细胞,发现细胞增殖能力增加(P<0.05)、细胞内 Caspase-3 活性下降(P<0.05),表明 miR-182 可改善 PCB1254对RGC-5细胞增殖及凋亡功能的影响。结论:抑制miR-182的表达可能是PCB1254影响RGC-5细胞增殖和凋亡进而导致功能损害的重要机制。第二部分miR-182参与PCB1254引起RGC-5细胞功能异常的分子机制研究目的:研究miR-182参与PCB1254引起RGC-5功能异常的分子机制。方法:1.分别配置浓度为 0.125、0.25、0.5、1.0 mg/L 的 PCB1254对 RGC-5细胞进行暴露处理,并设立空白对照及0.01%甲醇对照组,测定细胞内FGF9及MAPK/ERK信号通路p-ERK1/2的表达水平。2.利用miR-182 mimics或miR-182 inhibitor转染RGC-5细胞,使miR-182上调或下调,分别检测FGF9及p-ERK1/2的表达水平。3.构建FGF9-3’UTR野生型与FGF9-3’UTR突变型的双荧光素酶报告质粒,分别与NC或miR-182 mimics共转染293T细胞,观察荧光素酶活性的变化。4.利用FGF9过表达慢病毒感染RGC-5细胞,检测细胞周期、细胞增殖及细胞凋亡功能的变化,并检测p-ERK1/2的表达水平。5.使用0.5、1.0 mg/L的PCB1254刺激RGC-5细胞,再分别感染阴性对照病毒、FGF9干扰慢病毒,检测细胞增殖、细胞凋亡功能的变化。结果:1.当PCB1254暴露浓度(?)0.5 mg/L时,RGC-5内FGF9 mRNA水平显著增高(P<0.05)、FGF9蛋白水平也显著高于对照组(P<0.01),与此同时p-ERK1/2 蛋白水平亦上调(P<0.01)。2.与 NC 组相比,miR-182 inhibitor 组RGC-5细胞内FGF9 mRNA水平增高(P<0.05),FGF9蛋白水平与p-ERK1/2蛋白水平均增高;miR-182 mimics组细胞内FGF9 mRNA水平降低(P<0.05),FGF9蛋白水平与p-ERK1/2蛋白水平均降低。3.荧光素酶活性分析,在转染FGF93’UTR野生型质粒组,与NC组相比,miR-182 mimics组的荧光素酶活性显著降低(P<0.001),在转染FGF-9 3’UTR突变型质粒组,与NC组相比,miR-182 mimics组的荧光素酶活性无明显变化(P>0.05),表明FGF9是miR-182的作用靶基因。4.使用FGF9过表达慢病毒感染RGC-5,RGC-5细胞周期无显著变化(P>0.05),但可引起RGC-5细胞活力降低(P<0.01),细胞内Caspase-3活性增高(P0.001),p-ERK1/2水平增高。5.分别使用阴性对照病毒、FGF9干扰慢病毒感染0.5、1.0 mg/L PCB1254暴露后的RGC-5细胞,发现与感染阴性对照病毒组相比,FGF9干扰慢病毒感染组细胞活力增加(P<0.05)、细胞内Caspase-3活性下降(P<0.05)、p-ERK1/2的表达降低。结论:miR-182可能通过靶向FGF9激活MAPK/ERK信号通路参与PCB1254对RGC-5细胞功能的损伤过程。