论文部分内容阅读
首个细胞谱系的分化，即滋养外胚层和内细胞团的出现，是哺乳动物早期胚胎发育过程中发生的关键性事件之一。滋养外胚层将发育成胎儿的胚外结构，而内细胞团注定发育成胚胎及一部分胚外结构。由谱系追踪实验指出，这种分化可被追溯至2-细胞期，2细胞胚胎先分裂的卵裂球的后代主要形成囊胚的胚胎部分，晚分裂的卵裂球的后代主要形成对胚极部分。并且，从2-细胞到4-细胞期的过渡时会出现异时卵裂和纺锤体旋转现象，因此，目前许多研究人员都聚焦到2-细胞胚胎姐妹卵裂球基因差异表达的研究上。但由于取材困难、样品量较低，一直进展缓慢。直到现在，也未能发现第二次有丝分裂的卵裂方向及次序与囊胚胚轴确立相关的基因。本文对小鼠2-细胞晚期胚胎姐妹卵裂球mRNA和蛋白水平不对称分布情况进行检测，寻找这种基因，为研究早期胚胎发育过程的调节机制打好理论基础。1.本试验首先应用表达谱芯片呈现了小鼠2-细胞晚期最后3h胚胎的基因表达谱变化，并对差异表达的基因进行了信号通路分析，发现有许多重要的信号通路，如Wnt信号通路、Notch信号通路、MAPK信号通路等，在此时期发挥作用。之后，挑选12条感兴趣的基因使用半定量RT-PCR技术对芯片结果进行验证，结果显示，除Ascl1、Blnk、Etv3、Foxg1、Sox17不表达外，其它7条基因Βeta-actin、Axin1、Cdc25c、Cdkn2d、Mta2、Pin4、Yy1都显示出特异性电泳条带，并且这12条基因的变化趋势与基因芯片结果完全符合，证明这次的表达谱芯片的结果仍具有很好的可靠性，可以给后续的研究提供参考。2.随后应用单细胞RT-PCR技术呈现了小鼠2-细胞晚期hCG注射后49h姐妹卵裂球中Βeta-actin、Axin1、Cdc25c、Cdkn2d、Mta2、Pin4、Yy17个基因的表达图案，结果显示在hCG注射后49h的胚胎中一个卵裂球与另一个卵裂球相比Axin1、Cdc25c、Cdkn2d、Mta2mRNA表达显著增加，Pin4mRNA表达显著降低，而Βeta-actin、Yy1mRNA表达没有显著变化，证实在2-细胞胚胎姐妹卵裂球中的确存在转录本的不对称分布。3.从上述姐妹卵裂球中差异表达的基因中挑选与胚轴形成和细胞有丝分裂有关的Axin1、Cdc25c和Cdkn2d3条基因应用荧光定量PCR技术和RT-PCR技术进一步鉴定在小鼠2-细胞晚期单卵裂球中的分布，结果显示Axin1、Cdc25c和Cdkn2d mRNA在2-细胞晚期单卵裂球之间呈现差异表达，并且，Axin1、Cdc25c和Cdkn2d mRNA在同一个卵裂球中高表达。进一步证实胚胎的不对称性在2-细胞期就已经出现，并且这种不对称性有可能与第二次有丝分裂分裂面的方向与分裂次序，以及胚轴建立有关。4.本试验构建了pET28a-Axin1、pET28a-Cdc25c和pET28a-Cdkn2d三种重组质粒，转入BL21后经IPTG诱导分别得到三种可溶性蛋白。用纯化的三种蛋白当做抗原分别免疫动物，得到了兔抗Cdc25c、Cdkn2d的多克隆抗体血清，和鸭抗Axin1的多克隆抗体血清。经辛酸-硫酸铵法纯化后，用Western Blots检测，显示三种抗体特异性良好。使用这些抗体进行双标染色和DAPI复染，研究了内源性Axin1与Cdc25c或Axin1与Cdkn2d两组蛋白在小鼠2-细胞晚期胚胎中的亚细胞定位和姐妹卵裂球之间的表达情况。结果显示，Axin1存在于小鼠2-细胞晚期胚胎卵裂球的胞浆中，呈斑点状着色，并且所有被观察的51枚染色胚胎中，姐妹卵裂球之间Axin1的表达呈现或多或少的不对称性；Cdc25c仅存在于小鼠2-细胞晚期胚胎（12枚）卵裂球的细胞核中，并且在姐妹卵裂球中也具有表达的不对称性；Cdkn2d存在于小鼠2-细胞胚胎（39枚）卵裂球靠近外部环境的近细胞膜的胞质区，卵裂球间接触部位的近细胞膜的胞质区无着色，并且在姐妹卵裂球中也具有表达的不对称性；并且双标染色显示这三种蛋白都在同一个卵裂球中高表达。这些结果与其mRNA的分布情况相符合，预示三者可能以某种未知的方式直接或间接相互作用来影响早期胚胎发育。5.本试验通过对超数排卵与正常发情时4-细胞胚胎形状的观察发现正常发情鼠4-细胞时形成的100%是正四面体构型的胚胎；超排鼠在4-细胞时形成两种类型的胚胎，即占多数的正四面体形胚胎和少数的非正四面体胚胎。体外培养的结果显示不同构型的4-细胞阶段胚胎都能发育的到囊胚。并且通过使用半定量RT-PCR技术检测Beta-actin、Axin1、Cdc25c、Cdkn2d、Mta2、Pin4、Yy17条基因的表达图案，结果显示这7条基因的mRNA在正四面体胚胎中的表达量显著高于非正四面体胚胎。这些结果提示超数排卵对2-细胞胚胎单卵裂球中基因表达是有影响的，进而影响了第二次有丝分裂的分裂面的方向与次序。但这种影响只是在表达量上不同，对体外继续发育到囊胚无显著影响。