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研究背景:脊髓小脑共济失调12型(SCA12)是一种迟发型常染色体显性遗传的神经退行性疾病。该病由PPP2R2B5’-UTR中非编码的三核苷酸CAG/CTG重复扩增突变导致的。研究表明PPP2R2B突变导致其编码蛋白PPP2R2B水平上调,而PPP2R2B是细胞内重要的磷酸酶PP2A的调节亚基。可通过将靶蛋白去磷酸化的方式调控各类信号通路,包括细胞自噬通路等。近年来的研究发现细胞自噬标志性蛋白LC3B,在线粒体自噬等过程中受到磷酸化调控,然而去磷酸化在相关过程中的作用则尚无探索。目的:研究PPP2R2B作为PP2A的重要组成部分,是否参与调节LC3B去磷酸化,以及LC3B的磷酸化水平改变对线粒体自噬产生的影响,并探索具体的分子机制,从而明确线粒体自噬和SCA12发病之间的关系。方法:(1)用抗霉素(Antimycin A)和寡霉素(Oligomycin)处理表达Parkin和OPTN的HEK293细胞以诱导线粒体损伤,从而构建PINK1/Parkin介导的线粒体自噬细胞模型;(2)通过ATG8家族蛋白的同源性比对预测LC3B的磷酸化位点,利用分子克隆技术对磷酸化位点突变,观察LC3B磷酸化位点突变体在细胞内不同的表型;(3)通过在体外表达具有荧光标签的线粒体自噬受体OPTN和野生型或突变型LC3B,探究不同磷酸化水平的LC3B与OPTN的结合关系,并通过PLA(Proximity Ligation Assay)技术进一步探究细胞内两者结合水平;(4)通过药物筛选,确定磷酸酶药物对LC3B的影响,再通过Knockdown内源性PP2A,并用Phos-tag蛋白免疫印迹技术进一步验证PP2A对LC3B磷酸化的调控作用;(5)利用PCR分子克隆技术从人类cDNA文库里构建出表达PPP2R2B的质粒,并在线粒体自噬模型中观察PPP2R2B的分布与线粒体招募情况;(6)原代培养小鼠皮层神经元,验证LC3B的磷酸化对神经元线粒体自噬及存活的影响,并探索线粒体自噬的功能障碍对神经元存活及SCA12发病的影响。结果:(1)在A/O诱导的线粒体自噬模型里,LC3B可以在自噬受体OPTN的介导下被大量募集到受损线粒体,而去磷酸化位点突变的LC3B募集到受损线粒体受阻,拟磷酸化突变体募集到线粒体的数量增加;(2)LC3B的拟磷酸化突变体与OPTN的结合比野生型更强;(3)初步筛选药物发现PP2A抑制剂对LC3B募集到线粒体有影响,而PP2A的激活剂降低了 LC3B的磷酸化,抑制了 LC3B募集到线粒体。Phos-tag免疫印迹也证明了 LC3B磷酸化水平的变化;(4)在线粒体自噬模型中,PPP2R2B会被大量募集到线粒体外膜,但是过表达PPP2R2B的细胞中LC3B募集到线粒体受阻;(5)在敲低PPP2R2B的原代皮层神经元中,过表达PPP2R2B会造成线粒体自噬缺陷、损伤神经元细胞,而通过DFP诱导线粒体自噬可以逆转PPP2R2B造成的神经元损伤。结论:在PINK1/Parkin介导的线粒体自噬中,LC3B在自噬受体OPTN介导下募集到受损线粒体,而LC3B招募到线粒体的过程受其磷酸化水平的调控。PPP2R2B作为催化亚基募集PP2A全酶至线粒体,并进一步将LC3B的93位苏氨酸位点去磷酸化,从而影响LC3B和OPTN的蛋白相互作用以及LC3B向受损线粒体的招募。在神经元内,过表达PPP2R2B会造成线粒体自噬缺陷,影响神经元的生存状态,而自噬激活剂DFP诱导线粒体自噬可以逆转这种损伤。