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目的: Tfs3基因簇目前认为是幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统(typeⅣsecretion system,T4SS)编码基因簇之一,位于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)塑性区,但其在H.pylori中的作用尚不清楚。hp4565基因(与virB11同源)是tfs3结构基因之一,其生物学特性在目前查的文献还未见报道。为此,本论文以H.pylori塑性区hp4565基因作为研究对象,将其克隆表达出HP4565重组蛋白,并制备了抗HP4565蛋白抗体,初步研究了重组HP4565蛋白的理化特性和功能,旨在寻找hp4565基因在tfs3结构中的作用,为进一步研究hp4565基因的功能和H.pylori的致病机制,以及为H.pylori感染的诊断治疗等奠定基础。 方法: 1.根据基因库中H.pylori Shfi470的hp4565的全基因组序列设计h4565基因的PCR引物,以H.pylori临床株为模板,扩增hp4565基因。 2.T-A克隆后经pET-30原核表达系统获得大量HP4565融合蛋白。经Ni2+-NTA柱纯化蛋白,蛋白复性使用尿素梯度透析法。 4.将纯化HP4565蛋白免疫白兔获取抗血清并检测抗体效价。 5.定磷法检测HP4565蛋白ATP酶活力 6.MTT法检测HP4565蛋白对胃上皮细胞增殖的影响。 结果: 1.成功克隆了幽门螺杆菌临床株中hp4565基因,hp4565基因全长942bp,编码313个氨基酸,与幽门螺杆菌菌株G27、J99、 Cuz20、Shfi470序列的核苷酸同源性为98%~100%。 2.工程菌经IPTG诱导后,电泳显示有41kDa的融合蛋白,经Western blot鉴定是HP4565目的蛋白。纯化复性后,HP4565蛋白浓度、纯度较高。 3.免疫白兔获得了效价为1∶1.6×105的抗血清。 4.纯化后的重组蛋白作用胃上皮细胞后,发现在低浓度(≤40μg/ml)时,每一时段各浓度间无显著差异;蛋白浓度在60μg/ml以上,培养6小时,浓度间无显著差异(P>0.05),当培养24小时后,细胞增殖率和低浓度相比显著减低(P<0.05)。 5.HP4565重组蛋白ATP酶活力为92.4U×mg prot-1×hour-1。 结论: 1.成功克隆、表达了临床株中塑性区的hp4565基因。 2.得到纯度和浓度较高的HP4565蛋白。 3.获到较高滴度的兔抗HP4565的抗血清。 4.HP4565蛋白一定程度上影响胃上皮细胞的增殖,且和培养时间及蛋白剂量呈现一定的量效关系。 5.HP4565重组蛋白有ATP酶活性,和cag致病岛的cagα同样。