第一部分、Grp78的同源模建及其HEV衣壳蛋白E2s的分子对接研究　　 背景和目的：戊型肝炎病毒是急性肝炎的重要病因，并且在孕妇感染时很容易导致重症肝炎，具有较高的死亡率，死亡率高达20％。HEV基因组中的ORF2编码单个结构蛋白，该蛋白能形成二聚体，并最终组装成为病毒衣壳。先前的研究已发现截短的重组ORF2蛋白(aa368-606，p239)能形成直径为23 nm的颗粒并能以类似病毒入胞的方式进入易感细胞内。在此基础上，我们首次报道了一个ORF2截短蛋白E2s(aa455-602)的晶体结构(PDB3GGQ)，分辨率达2.0()。该结构显示为一个内侧包含疏水孔的β桶状结构，进一步的实验表明这一结构正好位于HEV衣壳的突出部位，很可能参与病毒感染过程中与细胞的相互作用。　　 我们更早的研究发现ORF2片段p239(aa368-606)能在体内和体外条件下结合Grp78分子伴侣蛋白。而Grp78是70kDa热休克蛋白家族中的一员，参与许多细胞过程，包括钙库的调节、新生蛋白的转运、折叠和成熟。尽管Grp78在参与病毒感染和复制方面的具体机制尚不清楚，但越来越多的证据表明在病毒感染后中许多病毒蛋白能上调Grp78的表达。另外Grp78本身也能与病毒的蛋白质结合并至少行使以下两种功能：促进蛋白折叠并组装成颗粒，纠正错误折叠的病毒蛋白。细胞实验证明Grp78能在病毒感染后在细胞膜和内质网中检测到，我们推测Grp78很可能参与了HEV的入胞过程。考虑到Grp78本身具有的多种调节功能，其与HEV衣壳蛋白的结合可能在病毒感染周期中发挥了重要的作用。　　 方法：本研究利用同源模建的方法对Grp78的结构进行预测，Grp78属于Hsp70家族，PDB蛋白结构数据库中有许多该家族成员的晶体结构，根据这些模板构建的结构具有较高的准确度。使用Ramachandran图、Profile-3D以及PROCHECK程序对模建结构评价并进一步修正，使用基于CHARMM力场的能量最小化对结构进行收敛，使用Side-Chain Rotamers对侧链进行调整，最后使用分子动力学对结构进行优化以获得实际环境下的稳定结构。E2s的结构经过上述动力学方法优化后，在InsightⅡ软件包的ZDOCKpro模块中，Grp78和E2s通过ZDOCK进行分子对接，从Zdock的输出文件中，前1000个复合物被筛选出来进入下一步的Rdock分析。综合Zdock分值，Rdock分值，并考虑E2s在HEV VLP上的相对位置，选定一个最优复合物结构进行下一步分析。　　 计算并比较复合物及单体的总能量，利用Simulation模块中的CalculateInteraction Energy流程计算Grp78与E2s相互作用交界面氨基酸的相互作用能。统计复合物在动力学达到平衡后的时间段内氢键的出现频率及其键长。分别测试配对前的两个单体的SA和配对后完整结构的SAS，统计在结合部位溶剂可及表面发生较大改变的氨基酸。利用InsightⅡ的Delphi模块计算蛋白质分子的表面静电势，将计算结果以静电势能的形式显示于分子的表面。利用LigPlot绘制交界面的相互作用情况，分析E2s与Grp78之间的疏水作用情况。　　 结果：同源模建具有较高的准确度，利用PDB蛋白结构数据库中的搜索工具，能找到一些列与Grp78同属于一个家族的模板结构，平均序列一致性达到67％。对模建结果的拉曼传强图的分析显示，结构仅有11个氨基酸(1.8％)位于最优区域外。将profile-3D结果按照氨基酸残基和分值作图，可见模建结果在约400aa处有一数值低谷，提示此处结构可能不够合理，但对模板1YUW的结构进行的Profile-3D分析也可见相同的走势情况。将所得结构与模板1YUW叠加时RMSD值仅为约0.65()，模建结构和模板一样都包含有N端结构域和C端结构域，二者以链接区相连。　　 在对接实验中，Grp78作为受体蛋白，E2s作为配体蛋白，检查前100个RDock对接结果，从中选出6个ZDock和RDock分数排名均靠前的代表性结构作为候选复合物结构：C035，C277，C290，C441，C779和C859，再根据最新报道的HEVVLP结构，将6个复合物结构叠加到VLP的结构上，检查Grp78与VLP表面的碰撞情况，对这六个结构进行结合位阻的筛选并排除不合理的结构，最终选择C035作为对接结果。复合物结构中E2s二聚体其中一个单体的凹槽区正对着Grp78底物结合域的αA螺旋区和5β-和6β-折叠片区，另一个单体则与Grp78的链接区保持相互作用。　　 复合物结构C035再次进行500 ps的分子动力学的优化，达到平衡后选取能量值最低的结构进行蛋白相互作用的分析。能量优化后的E2s和Grp78的总能量分别为-1513.23 kcal/mol和-5968.34 kcal/mol，而它们形成复合物后总能量为-7796.77 kcal/mol，比二者能量之和还少-315.2 kcal/mol。对复合物的氢键分析发现一系列强作用力氢键，其中还包括两个三重氢键，这些氢键在Grp78和E2s的相互作用上发挥了重要的作用。溶剂可及表面的分析也提示许多位于相互作用界面的关键氨基酸。表面静电势的分析显示Grp78在整个相互作用交界面的静电势为负，E2s在与Grp78相互作用的交界面则由两侧两个带正电的区域和中间带负电荷的区域组成，而中间静电势为负的区域恰好属于凹槽区，因此交界面的静电相互作用有可能驱动复合物的形成并维持其结构的稳定。综合多种不同的分析方法，最终可以得到一系列的关键氨基酸，这些氨基酸残基在Grp78和E2s的相互作用中起着重要作用，其中同时参与多种作用的氨基酸可能更具代表性。　　 结论　　 利用一系列已知的同源结构模板，成功对Grp78全长进行了同源模建，并验证了该结构的合理性。　　 将同源模建的Grp78和本中心报道的晶体结构E2s进行分子对接，获得一个Grp78：E2s复合物的结构预测。　　 通过对预测复合物结构的分析并结合相关文献报道，得到一些列在E2s上与HEV入胞重要相关的氨基酸位点：Thr489、Arg524、Ser488、Ser489、Ala590、Tyr561和Asn562。　　 E2s与Grp78的结合可能影响Grp78与分子伴侣J的结合，并进一步阻断相关底物结合到Grp78的底物结合域。