研究背景糖尿病与心血管疾病的关系十分密切,2001年美国国家胆固醇教育计划成人治疗指南Ⅲ(ATPIII)将糖尿病列为冠心病等危症。中国流行病学调查研究显示,糖尿病住院患者中冠心病的发病率为52.9%。糖尿病患者的心源性死亡率比非糖尿病患者高2-4倍,糖尿病引起的死亡中65%是源于心血管疾病。目前对于糖尿病伴缺血性心脏病的治疗措施主要有经皮冠状动脉介入治疗(PCI)、冠状动脉旁路移植术(CABG)、药物治疗等。虽然现有方法能够迅速开通血管,但有许多患者仍不可避免的发生心力衰竭,使得糖尿病伴缺血性心脏病的治疗遇到了难以突破的瓶颈。干细胞移植为缺血性心脏病的患者带来了希望,许多研究表明,骨髓单个核细胞(BMMNC)移植可显著改善患者左室功能,逆转左室重构,延缓心力衰竭的发展进程。因此,本研究的第一部分拟观察骨髓单个核细胞移植辅助PCI术治疗糖尿病伴急性心肌梗死的安全性和疗效。目前对于糖尿病伴缺血性心脏病的治疗药物种类繁多,包括阿司匹林、氯比格雷、血管紧张素转换酶抑制剂、他汀类调脂药等。我们的前期研究表明,丹参酮IIA这一中药提取物,对于缺血性心脏病疗效确切,并具有潜在的抗心律失常作用。那么丹参酮IIA对于糖尿病伴缺血性心脏病的疗效如何?其发挥作用的分子机制是什么?目前尚不清楚。众所周知,PI3K/Akt途径是一条经典的细胞生存信号途径,该信号途径激活后,可降低高血糖引起的心肌细胞凋亡增多,抑制心肌内炎症反应,从而降低心肌损伤。因此,本研究的第二部分拟观察①丹参酮IIA对于糖尿病伴缺血性心脏病的保护作用;②该作用是否与PI3K/Akt途径相关。研究目的1.观察骨髓单个核细胞(BMMNC)移植对于糖尿病伴ST段抬高急性心肌梗死的安全性和疗效;2.构建糖尿病大鼠缺血再灌注损伤模型,观察丹参酮ⅡA对于糖尿病大鼠心肌梗死面积、左室功能、心肌细胞凋亡的影响;3.阐明丹参酮ⅡA对于糖尿病大鼠缺血再灌注损伤的保护作用是否与PI3K/Akt信号途径相关。研究方法1.骨髓单个核细胞(BMMNC)移植对于糖尿病伴ST段抬高急性心肌梗死的安全性和疗效研究1.1选择罪犯血管为第2对角支近端LAD病变的STEMI患者,发病12h内行PCI治疗,符合纳入排除标准,签署知情同意书的患者纳入试验,随机分为BMMNC组和对照组。共纳入86例患者,其中BMMNC组41例,对照组45例。BMMNC组糖尿病患者n=10,对照组糖尿病患者n=12。1.2所有患者给予缺血性心脏病常规用药,根据是否患有糖尿病,给予血糖控制治疗。记录详细病史、各项血清学指标、心电图(ECG)、超声心动图(UCG)、核素心肌灌注扫描(SPECT)结果。1.3 PCI术后7天在局部麻醉下从患者髂前上嵴抽取骨髓液40 ml,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞(BMMNC)。将分离的BMMNC重悬于10ml肝素化生理盐水中,细胞数量约为5±1.2×108 /ml。细胞活力为96±3.2%,CD34+阳性细胞数为1.8±0.6%。1.4冠脉内注射BMMNC,将10ml细胞悬液分4次注射入罪犯血管内,对照组注射同体积的生理盐水。1.5细胞移植后1月、3月、1年记录患者ECG,UCG,SPECT结果和血清学指标。细胞移植后6月、4年时,除上述各项指标外,加做冠状动脉造影检查。随访期间记录主要心脏不良事件(MACE)发生情况,包括心源性死亡、非致死性心肌梗死、靶血管重建等。2.丹参酮IIA对糖尿病大鼠心脏缺血/再灌注损伤的作用及机制2.1选取体重180-220g雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,腹腔注射STZ(50mg/kg),以2次随机血糖≥16.7mmol/L认为糖尿病模型造模成功。2.2注射STZ成功建模后7w,丹参酮IIA组腹腔注射TSN(5mg/kg), 1/d,连续7d;Wormannin组每次TSN注射前10min,尾静脉注射PI3K特异性抑制剂Wormannin (16μg/kg),假手术组和缺血再灌组给予同体积生理盐水。2.3 STZ注射后8w结扎大鼠冠状动脉左前降支(LAD),构建缺血再灌注模型,3%异氟烷吸入麻醉,缺血30min,再灌注3h或24h。2.4十六道生理记录仪记录STZ注射前、STZ注射后7w、缺血再灌注前后血流动力学指标(±LV dp/dtmax)。2.5超声心动图记录记录STZ注射前、STZ注射后7w、缺血再灌注前后左室功能指标(ESV, EDV, LVEF)。2.6 Evans blue与TTC双染测量缺血区及梗死区面积。2.7 TUNEL染色及caspase活性检测观察心肌细胞凋亡。2.8 Western-Blot检测Akt, p-Akt (Ser 473), NF-κB表达。2.9 ELISA检测炎症因子TNF-α, IL-6表达,髓过氧化酶(MPO)表达。研究结果1.骨髓单个核细胞(BMMNC)移植对于糖尿病伴ST段抬高急性心肌梗死的安全性和疗效1.1 BMMNC移植可安全用于ST段抬高急性心肌梗死的辅助治疗。MACE事件发生情况如下:冠状动脉造影提示,对照组1例(2.2%)患者发生冠脉内再狭窄,1例(2.2%)患者死亡。BMMNC组1例患者(2.4%)发生急性左心衰。1.2超声心动图结果提示,各组患者LVEF均显著改善,与对照组比较,BMMNC组的LVEF在6个月随访(0.484±0.5 vs 0.457±0.6, p = 0.001), 1年随访(0.482±0.7 vs 0.446±0.6, p<0.001)和4年随访时(0.505±0.8 vs 0.464±0.8, p<0.001)改善更为显著。BMMNC组和对照组的WMSI在4年随访期间均降低,对照组的WMSI在6个月随访(1.43±0.01 vs 1.48±0.02, p = 0.04),1年随访(1.35±0.02 vs 1.41±0.02, p = 0.02)和4年随访时(1.23±0.01 vs 1.37±0.03, p<0.001)显著低于与BMMNC组。1.3 BMMNC组LVEF变化值显著高于对照组LVEF变化值(mean change 3.5 (Cl 95%, 1.4 to 5.5), p = 0.001)。BMMNC组ESV降低值显著高于对照组ESV降低值(mean change -7.6 (Cl 95%, -11.9 to -3.3), p<0.001)。BMMNC组WMSI变化值显著高于对照组WMSI变化值( mean change -0.16 (Cl 95%,-0.24 to -0.08), p<0.001)。1.4 SPECT结果提示,BMMNC组和对照组的心肌梗死面积(IS)均降低,组间心肌梗死面积比较,无统计学差异(0.263±0.007 in BMMNC group vs 0.281±0.008 in control group, p = 0.10)。BMMNC组IS变化值与对照组IS变化值比较,无显著统计学差异(-9.5±0.9 in BMMNC group vs -7.1±0.9 in control group, p = 0.06)。1.5糖尿病合并STEMI患者行BMMNC移植后,4年随访时LVEF显著提高(47.9±0.6 vs 40.3±0.7, p<0.001)。对照组的糖尿病合并STEMI患者,4年随访时LVEF无明显改善(43.1±0.8 vs 40.1±1.0, p=0.062)。1.6无论是在细胞移植组或是对照组,非糖尿病患者LVEF变化值均高于糖尿病患者LVEF变化值(BMMNC: (9.7±1.0) vs (7.6±0.9),p = 0.258; Control (6.7±0.8) vs (3.0±0.7), p=0.014)。2.丹参酮IIA对糖尿病大鼠心脏缺血/再灌注损伤的作用及机制2.1丹参酮IIA改善糖尿病大鼠缺血再灌注后左室功能:血流动力学结果提示,与I/R组比较,TSN显著增加左室等容期压力最大变化速率(+LVdp/dt max: 4378.4±365.0 vs 3989.9±415.8mmHg/s,p<0.05;-LVdp/dt max:4205.4±329.6 vs 3722.0±541.9 mmHg / s, p<0.05;)。在TSN注射前给予Wortmannin,-LVdp/dt max显著低于TSN组(3830.9±382.0 vs 4205.4±329.6 mmHg / s, p<0.05)。超声心动图结果提示,与I/R组比较,TSN显著降低LVESV(0.31±0.08 vs 0.40±0.07ml, p<0.05)及LVEDV(1.36±0.05 vs 1.42±0.07 ml, p<0.05),同时显著增加LVEF (0.770±0.058 vs 0.716±0.054, p<0.05)。在TSN注射前给予Wortmannin,LVEF显著低于TSN组(0.713±0.045 vs 0.770±0.058, p<0.05),LVESV显著高于TSN组(0.39±0.06 vs 0.31±0.08 ml, p<0.05)。2.2丹参酮IIA降低糖尿病大鼠缺血再灌注后心肌梗死面积:Evans Blue和TTC双染法计算I/R后心肌梗死面积结果示,与I/R组比较,TSN组心肌梗死面积显著降低(0.252±0.038 vs 0.327±0.027, p<0.05),Wortmannin组心肌梗死面积显著高于丹参酮IIA组(0.312±0.040 vs 0.252±0.038, p<0.05)。2.3丹参酮IIA降低糖尿病大鼠缺血再灌注后心肌细胞凋亡指数: TUNEL染色结果表明,TSN组心肌细胞凋亡指数显著低于I/R组(0.114±0.026 vs 0.191±0.023, p<0.05)和wortmannin组(0.114±0.026 vs 0.154±0.024, p<0.05)。Caspase-3活性测定结果提示TSN组caspase-3活性显著低于I/R组(60.0±17.2 vs 114.7±13.0, p<0.05)和wortmannin组(60.0±17.2 vs 108.9±13.4, p<0.05)。2.4丹参酮IIA显著增加糖尿病大鼠缺血再灌注后p-Akt表达:Western blot法检测p-Akt (Ser 473)表达,结果示,TSN显著增加糖尿病大鼠缺血再灌注后p-Akt (Ser 473)表达(p<0.05),Wortmannin则显著抑制TSN引起的p-Akt表达增加(p<0.05)。2.5丹参酮IIA降低糖尿病大鼠缺血再灌注后NF-κB p65磷酸化:Western blot结果提示,与Sham组比较,I/R组NF-κB p65磷酸化显著增加(p<0.05),TSN显著降低p- NF-κB p65表达(p<0.05),Wortmannin可抵消TSN对于p- NF-κB p65的影响(p<0.05)。2.6丹参酮IIA降低糖尿病大鼠缺血再灌注后IL-6,TNF-α生成:ELISA结果提示,与Sham组比较,I/R导致IL-6 (p<0.05)和TNF-α(p<0.05)表达显著增高。与I/R组比较,TSN显著降低IL-6 (p<0.05)和TNF-α(p<0.05)表达。与TSN组比较,Wortmannin预处理显著增加IL-6 (p<0.05)和TNF-α(p<0.05)表达。2.7丹参酮IIA降低糖尿病大鼠缺血再灌注心肌中性粒细胞浸润:与I/R组比较,TSN显著降低心肌MPO活性(23.7±3.4 vs 30.3±4.7 U/100mg, p<0.05)。预先给予Wortmannin可抵消TSN的作用(29.0±4.2 in wortmannin group vs 23.7±3.4 U/100mg in TSN group, p<0.05)。研究结论1. BMMNC移植可安全有效改善STEMI患者左室功能,非糖尿病伴STEMI患者BMMNC移植疗效可能优于糖尿病伴STEMI患者。2.丹参酮IIA预处理可降低糖尿病大鼠心脏缺血再灌注损伤后的心肌梗死面积,改善左室功能,降低心肌细胞凋亡指数,减轻心肌组织炎症反应。丹参酮IIA对于糖尿病大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护机制之一,可能是通过PI3K/Akt途径来完成的。