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产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）是一类携带了前噬菌体编码的一种或两种志贺毒素基因的高致病性食源性致病菌,严重威胁人类健康。新疆是我国五大牧区之一,牛羊养殖业是新疆现代畜牧业发展的主导产业。牛羊是STEC菌株的天然宿主,其携带率可高达71%以上。为研究新疆牛源非O157 STEC菌株的主要志贺毒素蛋白Stx1及其亚基蛋白作用于肠上皮细胞（Human intestinal epithelial cells,HIEC）的致病机制提供科学依据。本研究内容（1）分析了新疆牛羊源非O157 STEC的Stx基因亚型,（2）用非O157 STEC H34菌株和表达的Stx1（Stx1A+Stx1B）、Stx1A、Stx1B蛋白作用于HIEC细胞,观察细胞的凋亡情况,同时检测受体蛋白和肌动蛋白（Gb3、Gb4、NMⅡ、Cdc42）的基因表达和蛋白表达情况,分析免疫相关基因的表达情况;（3）构建Stx1、Stx1A和Stx1B基因的荧光重组质粒后转染HIEC细胞,用共聚焦显微镜观察Stx1、Stx1A和Stx1B蛋白在HIEC细胞的表达和定位。主要研究内容和结果如下:1.新疆源非O157 STEC菌株的Stx亚型分析:对本实验室分离鉴定的56株牛羊源非O157 STEC菌株,提取DNA模板扩增Stx1和Stx2全长基因送公司测序后,分析Stx1和Stx2基因亚型。56株非O157 STEC菌株中有31株（55.4%）编码Stx1,只有3株（5.4%）编码Stx2,有22株（39.3%）同时编码Stx1+Stx2。测序结果分析53个Stx1的亚型只有2种,分别是Stx1a（66%）和Stx1c（34%）,25个的Stx2亚型有3种,分别是Stx2a（56.0%）、Stx2b（20.0%）和Stx2c（24.0%）。56株非O157STEC菌株共有8种Stx基因亚型组合,分别是Stx1a（30.4%）、Stx1c（25.0%）、Stx2a（1.8%）、Stx2b（1.8%）、Stx2c（1.8%）、Stx1a+Stx2a（23.2%）、Stx1a+Stx2c（8.9%）和Stx1c+Stx2b（8.9%）,其中Stx1a在组合中最常见,选定该基因为研究对象,检测新疆牛源非O157 STEC H34菌株的Stx1a亚型作用HIEC细胞后相关基因的表达情况和在HIEC细胞的定位。2.非O157 STEC H34菌株、Stx1A和Stx1B蛋白作用于HIEC细胞的基因表达情况:通过构建PEGX-6P-1-Stx1A和PEGX-6P-1-Stx1B的原核表达载体,纯化出Stx1A、Stx1B蛋白,采用CCK-8的方法确定了Stx1A、Stx1B和Stx1（Stx1A+Stx1B）蛋白分别作用于HIEC细胞的最佳作用量,分别是10.25μg、10.8μg、13.8μg。然后通过q PCR和Western Blot检测非O157 STEC H34菌株、Stx1、Stx1A和Stx1B蛋白作用于HIEC细胞后,受体蛋白Gb3、Gb4和肌动蛋白Cdc42在H34菌株、Stx1和Stx1A蛋白作用下均表达上调;My Hc-IIA、My Hc-IIB在H34菌株作用下表达上调,免疫相关基因IL-1β、TNF-a、TNF-R1、TLR4和TLR5在H34菌株、Stx1、Stx1A和Stx1B蛋白作用下表达均上调,IL1R1在Stx1蛋白作用下表达下调。3.志贺毒素Stx1、Stx1A和Stx1B蛋白在HIEC细胞的定位:成功构建了荧光重组真核载体p LVML-GFP-Stx1、p LVML-GFP-Stx1A、p LVML-GFP-Stx1B,将其转染至HIEC细胞中,以荧光质粒p LVML-GFP作为转染对照,通过共聚焦荧光显微镜观察,荧光重组质粒p LVML-GFP-Stx1A分布于细胞质的细胞器上,包裹在细胞核周围;荧光重组质粒p LVML-GFP-Stx1和p LVML-GFP-Stx1B分布在整个细胞里面（细胞质和细胞核中均有分布）。综上所述,本实验成功确定Stx1及其亚基进入HIEC细胞的方式,同时确定了Stx1、Stx1A和Stx1B蛋白在HIEC细胞中定位,为非O157 STEC菌株的Stx1a亚基作用于HIEC细胞的致病机制提供数据支撑,为该病的预防治疗提供科学依据。