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研究背景：糖尿病是以胰岛素相对不足和／或绝对不足导致以血糖升高为主要临床表现的代谢紊乱综合征,目前我国糖尿病患病率正逐年上升。作为体内唯一能分泌有降血糖功效激素——胰岛素的胰岛p细胞,其形态与功能的完整性对于糖尿病的发病有至关重要的作用,其中再生基因蛋白在胰岛细胞再生过程中具有重要作用,中医药在治疗糖尿病及对胰岛细胞的功能与数目调节方面也具有较明确的效果。降糖消渴颗粒是在立足肝脾肾辨证2型糖尿病理论指导下创制的方药。肝脾肾三脏功能失调,会产生一系列的病理改变,在正气虚的基础上常可见湿、热、瘀等邪气盛的表现。脾胃功能损伤,运化失司,酿生湿邪,久则化生湿热。黄连是降糖消渴颗粒组方中的重要药物之一,主要归脾胃经,功在祛除因肝脾肾功能失调而产生的湿热之邪。小檗碱是黄连、黄柏等清热利湿中药的主要成分之一本论文以胰岛素瘤细胞为研究对象,研究再生基因蛋白及降糖消渴颗粒中清热燥湿组分小檗碱对胰岛素瘤细胞的影响,进一步探讨糖尿病过程中胰岛细胞的损伤和抗损伤机制。研究目的：本研究分两方面：以小鼠胰岛瘤细胞(Min6)为研究对象,经小鼠再生基因蛋白2(mReg2)过表达的Min6细胞在应对促调往因素——毒胡萝卜素的干预后,内质网途径凋亡通路中蛋白表达的改变,分析探讨mReg2对胰岛细胞的保护作用,初步胰岛细胞的凋亡与抗凋亡机制；另外在此基础上,通过观察小檗碱干预Min6细胞后线粒体途径凋亡通路中各蛋白表达的改变,分析探讨小檗碱对胰岛细胞的影响,为清热燥湿药物在2型糖尿病的治疗过程中应用特点及注意事项提供实验依据。研究方法：实验一：以毒胡萝卜素(Tg,luM)干预mReg2过表达的小鼠胰岛瘤细胞(Min6-mReg2)和没有过表达mReg2的小鼠胰岛瘤细胞(Min6-VC)后,流式细胞术检测两种细胞的凋亡情况,通过IREla和eIF2a磷酸化的情况,ATF6.GRP78蛋白和mRNA水平的变化,分析两种细胞内非折叠蛋白反应和内质网应激情况的变化；并通过Akt、pSer473Akt、mTOR、pSer2448mTOR和mTOR复合物中p70S6K、Raptor、GβL的蛋白水平的表达,分析mReg2在保护Min6细胞凋亡过程中发挥的作用；应用Akt、mTORC1阻断剂后,mReg2对UPR和Akt-mTOR信号通路的影响。实验二：以不同浓度的小檗碱干预Min6细胞和小鼠原代胰岛细胞以不同时长,通过MTT比色法和流式细胞术分析其对细胞活性情况的影响,并对比不同浓度下其与链脲佐菌素(STZ)在不同浓度下对Min6细胞的影响。DNA fragment法检测细胞内DNA断裂情况,并检测细胞内Bax、Bcl-Caspase3、PARP1、AIF、色素C等蛋白表达量的改变。研究结果：实验一：1.Tg引起Min6-VC细胞中IRE1αand eIF2a的磷酸化程度为Min6-mReg2细胞中的3倍多(图A)呈时间相关性。2. Min6-mReg2细胞中ATF6分裂情况明显减轻。3.Tg引起Min6-VC细胞凋亡,约为空白对照组4倍,P<0.01。4. mReg2过表达降低高糖高脂诱发的Min6细胞中IRElα磷酸化程度。5. Min6-mReg2中GRP78的基础表达为Min6-VC中的5倍多(5.9+0.8),P<0.01。6. mReg2促进Akt及mTOR的磷酸化,激活mTORCl, pSer473Akt和pSer2448mTOR磷酸化水平高于MIN6-VC,分别为1.7±0.05、1.5±0.07倍,P<0.01。7.GRP78敲除后,IRE1α磷酸化水平升高。实验二：1.同一时间下,小檗碱对Min6细胞活性的影响呈浓度相关性,随剂量增大活性降低。5uM浓度处,细胞活性下降近一半44%,(P<0.01),20uM浓度时,活性下降83%(P<0.01)。2.小檗碱对Min6细胞活性的影响呈时间相关性,干预时间愈长活性越低。5uM、10uM时,干预4小时后,高剂量细胞活性下降约为25%(P<0.05)；8小时,低、高剂量组细胞活性分别下降约28%和53%(P<0.01)；至16小时,低、高剂量组细胞活性分别下降约65%和81%,P<0.01。3.小檗碱5uM、10uM干预小鼠原代细胞8小时,高剂量组胰岛细胞活性下降较低剂量组明显(P<0.05)。4.小檗碱干预16小时候,Min6细胞出现明显DNA破碎,且DNA破碎情况从1.25uM浓度时即出现。5.流式细胞术显示以小檗碱引起Min6细胞凋亡率随浓度、时间的增加而增加,8小时和16小时处均由统计学意义(P<0.01)。且高剂量组(10μM)的细胞凋亡率高于低剂量组(5uM)。6.链脲佐菌素对小檗碱致Min6凋亡有协同效果。两者连用后,出现明显协同效果,活性细胞数下降至5.5%(P<0.01)。7.小檗碱干预后,抗凋亡蛋白Bcl-2明显下降35%,而促凋亡Bax蛋白的急剧升高约23倍。细胞质中色素C升高约2.1倍,AIF升高约2.3倍,Apaf-1升高6.2倍。细胞凋亡最后会引起半胱天冬蛋白-3(caspase-3)的活化和断裂(10-17kDa),Parpl的激活是衡量细胞凋亡的标准之一。半胱天冬蛋白断裂升高2.5倍,Parp1活化升高2.2倍。P<0.01。结论：实验一：1.mReg2对胰岛素生成细胞有保护作用；2.mReg2能调控(增加)Raptor and GβL表达,增加促进Akt和mTOR磷酸化,激活Akt-mTORC1信号轴,增加GRP78的基础表达,最终起到减弱Min6细胞中未折叠蛋白反应的作用。3.Akt或mTORC1抑制剂能抑制mReg2对GRP78的调控。实验二：1.小檗碱对小鼠胰岛瘤细胞(Min6)活性存在抑制作用,且呈一定浓度相关性和时间相关性,即随浓度、时间的增加,对细胞的抑制作用逐渐加强,甚至诱导细胞凋亡。2.小檗碱通过增加促凋亡蛋白、抑制抗凋亡蛋白的表达,通过线粒体内色素C-Apaf-caspase3途径和AIF两方面,诱导Min6细胞凋亡。3.从西医角度,验证了传统中医关于清热燥湿药损伤脾阳的理论,提供了数据支持,进一步充实了肝脾肾三脏同调治疗糖尿病的理论,证明其安全合理性。本研究探讨了当前热点再生基因蛋白mReg2对胰岛素生成细胞有保护作用；从Akt-mTORC1信号通路及GRP78角度揭示了其可能的作用机制,为揭示胰岛细胞凋亡与抗凋亡的机制提供了新的思路与方法,也为今后研究中药保护胰岛细胞的作用提供新的靶点。从中医脏腑辨证理论层面,探讨胰腺组织与中医脾脏的关系,以及小檗碱在糖尿病发病及病程进展中的作用。在前期临床与实验研究的基础上,从毒理角度印证了从肝脾肾治疗2型糖尿病理论的合理性与安全性。以胰岛细胞凋亡与抗凋亡为切入点,探讨了清热燥湿单体可能存在的不良反应及作用机制。