随着溶栓及介入治疗技术的发展,急性心肌梗死(myocardial infarction, MI)患者的早期死亡率显著下降,使得大量存活患者进入MI后的恢复期。心脏在心肌损伤发生后,为了维持其射血功能,会进行一系列的修复反应,即心室重构(cardiac remodeling),表现为梗死区急剧扩展、变薄,非梗死区则代偿性扩张和肥厚。心室重构是一个极其复杂的病理进程,心肌纤维化是其重要环节。研究显示其细胞/分子机制主要是肌成纤维细胞(myofibroblasts, MyoFBs)在病变部位聚集、增生,大量分泌细胞外基质(extracellullar matrix, ECM):纤维性胶原、纤维连接素、糖蛋白等。研究表明,心肌纤维化中MyoFBs的一个重要来源是心脏成纤维细胞(cardiac fibroblast, CFs)的激活。炎症反应在心肌损伤后早期病理重构过程中起到关键作用,并与预后密切相关。研究表明有一系列炎症细胞和细胞因子共同参与心肌损伤的病理生理进程,并相互联系,构成复杂的网络。遗憾的是,目前尚未完全阐明这种炎症网络的调控机制。髓系抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是一群骨髓来源的具有CD11b+Gr-1+标志(小鼠)的抑制性细胞,可负向调控机体的免疫功能。MDSCs最初是在肿瘤宿主中被描述,目前已在大量的病理情况下被发现：感染、炎症、应用免疫抑制剂等。小鼠MI早期即可检测到大量CD11b+细胞动员和浸润心肌,参与MI急性炎症反应。目前,尚无关于CD11b+Gr-1+髓系细胞在MI后心肌纤维化进程中的报道。硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是一种无色、水溶性、臭鸡蛋气味的气体,传统观点认为H2S是一种有毒气体。直到20世纪90年代,研究发现机体存在内源性的H2S,其对神经系统,尤其是海马的功能具有调节作用,亦可调节消化系统及血管平滑肌张力等。目前,H2S已成为继一氧化氮(nitric oxide, NO)及一氧化碳(carbon monoxide, CO)之后的第三个气体信号分子(gasotransmitters),具有舒张血管、心脏保护、神经传递,及抗炎作用等。H2S已广泛应用于各个领域的研究,尤其在心血管系统中的应用日益增多。Johansen等应用Langendorff灌流离体心脏缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)模型(结扎LAD 30min,再灌注120min),结果显示,0.1-1μM硫氢化钠(sodium hydrosulfide, NaHS)灌流液可减小心肌梗死面积。在体动物模型(小鼠、大鼠、猪、犬)研究提示,NaHS (0.1-14 μmol/kg)治疗可减小心肌梗死面积。更重要的是,通过减少H2S气体分子浓度(CSE-/-或使用CSE抑制剂：L-C-Propargylglycine, PAG)则明显加重心肌损伤。本研究主要探讨外源性H2S-硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)对小鼠心肌缺血损伤后的保护作用及炎症反应相关新机制。对损伤微环境内心肌细胞、免疫细胞和成纤维细胞,开展了以下研究：(1)H2S抑制心梗后CD11b+Gr-1+髓系细胞向心肌组织的浸润和动员,减轻心肌损伤；(2)H2S抑制TGF-p1诱导的现在成纤维细胞向肌成纤维细胞的表型转化,减少心梗后心肌纤维化；(3)H2S对心肌细胞凋亡的作用及对凋亡信号通路-Bax/Bcl-2的影响。从一个崭新的角度探讨H2S对CD11b+Gr-1+髓系细胞在心肌损伤中的调控作用,以期寻找治疗心肌损伤、心肌纤维化的新靶点。本文分为三个部分。第一部分 硫化氢通过抑制炎症反应及凋亡保护急性心肌缺血损伤背景和目的H2S作为一种内源性信号分子,在心血管系统生理及病理进程发挥着重要作用。髓系抑制性细胞(MDSCs)是一群骨髓来源的具有CD11b+Gr-1+标志的抑制性细胞,在各种感染、肿瘤、急慢性炎症等疾病中大量存在,并负向调节机体的免疫功能。本研究主要探讨CD11b+Gr-1+髓系细胞在急性心肌损伤中的作用,观察NaHS在缺血心肌损伤中的抑制炎症反应及抗心肌细胞凋亡作用。实验方法采用永久结扎左冠状动脉制备小鼠MI模型。于术前5 min及术后60 mim,分别腹腔注射(i.p.)NaHS(1 mg/kg)。观察术后24h动物生存率、左心室功能、心肌梗死面积、心肌组织H2S浓度、流水细胞仪分析CD11b+Gr-1+细胞水平,及心肌细胞凋亡等。流式细胞仪分选脾脏CD11b+Gr-1+细胞进行基因芯片分析。主要结果NaHS可提高MI小鼠的存活率、改善左心室功能、减小心肌梗死面积、提高心肌组织H2S浓度、减少CD11b+Gr-1+髓系细胞向心肌组织的浸润,并通过调节Bax/Bcl-2凋亡信号通路抑制心肌细胞凋亡。另外,NaHS减少循环系统(外周血)的CD11b+Gr-1+髓系细胞水平,抑制CD11b+Gr-1+髓系细胞的脾脏动员。脾脏组织CD11b+Gr-1+细胞后进行基因芯片结果提示：H2S可上／下调一系列与炎症反应、趋化因子及凋亡相关的基因表达水平。结论(1)NaHS对急性MI所致的心肌损伤具有保护作用；(2)NaHS抑制CD11b+Gr-1+髓系细胞向心肌组织浸润和迁移,发挥抗炎作用；(3)NaHS调节Bax/Bcl-2凋亡信号通路,减少心肌缺血诱导的心肌细胞凋亡。第二部分 硫化氢对小鼠心肌梗后心肌纤维化的保护作用及机制背景和目的急性MI导致心室重构,表现为梗死区急剧扩展、变薄,而非梗死区则扩张和肥厚。心室重构直接导致心衰发生,并构成影响MI患者预后的关键因素。目前,研究认为炎症反应在心肌损伤后心肌纤维化、心室重构病理进程具有重要作用。本研究主要观察CD11b+Gr-1+髓系细胞在心肌损伤亚急性期(1 wk)及慢性期(4 wk)的作用,并探讨NaHS在心肌纤维化、心室重构进程中的作用及机制。实验方法采用永久结扎左冠状动脉制备小鼠MI模型。于术前5 min及术后60 mim,分别腹腔注射(i.p.) NaHS (1 mg/kg)。观察术后1 wk和/或4 wk动物生存率、左心室功能、存活心肌、心肌纤维化水平、CD11b+Gr-1+细胞水平、心肌细胞凋亡,及心脏肥厚和肺水肿等。主要结果NaHS可增加MI后小鼠的存活率、改善心功能及心室结构、增加心肌存活率、抑制CD11b+Gr-1+髓系细胞向心肌组织的浸润及迁移、减少心肌组织胶原聚集、抑制CFs向MyoFBs的转化、抑制心肌细胞凋亡,以及减轻MI后心脏肥厚和肺水肿等。结论(1) NaHS对MI后亚急性期(1 wk)及慢性期(4 wk)心肌纤维化具有保护作用；(2) NaHS抑制CD11b+Gr-1+髓系细胞向心肌组织浸润和迁移,发挥抗炎作用；(3) NaHS调节Bax/Bcl-2凋亡信号通路,减少心肌缺血诱导的心肌细胞凋亡；(4) NaHS抑制MI后CFs向MyoFBs的转化,减少胶原纤维的产生,抑制心肌纤维化的进程。和肥厚。心室重构直接导致心衰发生,并构成影响MI患者预后的关键因素。目前,研究认为炎症反应在心肌损伤后心肌纤维化、心室重构病理进程具有重要作用。本研究主要观察CD11b+Gr-1+髓系细胞在心肌损伤亚急性期(1 wk)及慢性期(4 wk)的作用,并探讨NaHS在心肌纤维化、心室重构进程中的作用及机制。第三部分 硫化氢抑制TGF-β1诱导的人心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的表型转化背景和目的心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts, CFs)在心脏纤维化(myocardial fibrosis, MF)及心室重构过程中具有重要作用。心肌在各种病理因素的刺激下,CFs向MyoFBs发生表型转化(特征是大量表达α-SMA蛋白),并合成和分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。其中转化生长因子-β1 (Transforming growth factor-β1, TGF-β1)是已明确的重要的刺激因子。本研究主要观察H2S是否影响TGF-β1诱导的CFs向MyoFBs的表型转化,并探讨其可能的机制。实验方法人心脏成纤维细胞(human cardiac fibroblasts-adult ventricle, HCF-av)在无血清培养基中饥饿16h,进行下一步实验。分为4组：(1) Control;(2) NaHS组：100μM NaHS干预细胞；(3) TGF-β1组：10ng/ml TGF-β1干预细胞；(4) NaHS+ TGF-β1组：100μM NaHS干预细胞30min,加10ng/ml TGF-β1继续培养24h,收集细胞进行细胞增殖、迁移、凋亡及western blot等检测。主要结果NaHS可显著减少细胞分泌TGF-β1水平,抑制TGF-β1诱导的HCF-av细胞增殖、迁移,调节细胞周期,减少HCF-av向MyoFBs的表型转化(下调α-SMA蛋白水平)及胶原合成(Ⅰ、Ⅲ胶原)。结论H2S抑制TGF-β1诱导的HCF-av向MyoFBs的表型转化,机制可能为H2S减少细胞分泌TGF-β1水平。