研究背景:随着城市化进程的推进,食物、饮水、空气等环境污染的加剧,恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年提高。胃癌和肠癌的发病率尤其高,早、中期胃癌和肠癌的病人,如无手术禁忌症,手术切除肿瘤是治疗的首选;晚期肿瘤病人以化疗、靶向等治疗为主。消化道吻合器等吻合耗材和超声刀等止血、组织分离设备的发展给外科医生进行消化道肿瘤切除手术中的胃肠道吻合及术中止血等提供了比较方便、安全的选择;但是随着医疗设备的发展,新的消化道吻合器技术、产品和止血设备不断升级,给胃肠外科医生提供了更为便捷和有效的手术工具,极大的缩短了手术时间,减少了病人的手术风险;然而,外科医生寻求更为高效、安全、便捷的消化道吻合方法及血管闭合设备的努力一直在继续。活体软组织高频焊接技术(HFEW)是近年来电外科发展的一个新领域。该技术是乌克兰国家科学研究院科技联合“E.O.巴顿电气焊接研究院”研发的最新技术,其技术应用形式为HFEW-300PATONMED高频电子焊接设备,HFEW-300 PATONMED(?)软组织高频焊接设备是一款新型的双极电外科软组织高频焊接设备,该设备可以通过焊接设备的终端)刀头感应组织的阻抗参数变化,反馈给中央控制器,经智能控制器实时调节输出功率,表现为精准控制闭合端软组织的温度变化结合操作者控制对软组织的机械压力作用,实现软组织的切割,电凝,连接(焊接)等功能。其电凝模式的生物学机制为:高频电流通过终端钳等产生热能,使软组织细胞膜破裂,释放蛋白,加速组织内热分子运动,冷却过程中伴随释放蛋白的复性,可以在结合处形成凝固性粘连,封闭软组织断端。同时,最大程度的减少周围组织损伤和细胞死亡,防止闭合端破裂,保证离断血管的安全性和高效性。按照仪器使用说明,凝结模式可以用于闭合血管和分离组织,粘结(焊接)模式可以用来吻合消化道器官;凝结模式有10个不同档位可供选择,分别是:dA0,dA1,dA2,dA3,dA4,dA5,dA6,dA7,dA8,dA9。在胃、肠外科手术中,血管的有效闭合、离断及组织的分离是外科操作的关键。小血管的闭合和组织分离已从早期的应用丝线结扎等方法发展到各种各样的电外科设备;早期的腹腔镜下丝线缝扎由于受到操作时间长、空间需求大、技术要求高等制约,止血效率低下,在分离组织和小血管闭合方面已经被超声刀等外科设备替代;其中,超声刀、ligasure能量平台等外科设备已广泛应用于临床外科术中进行止血和组织分离;但是,直径超过5mm的血管,一般情况下会考虑使用钛夹或带锁扣的塑料夹(Hem-o-Lock)结扎夹等进行钳夹后再分离。然而,一方面,临床上常用的ligasure、超声刀等血管闭合设备存在着大血管闭合质量不稳定;超过7mm的血管依然不能进行有效闭合,而钛夹、Hem-o-lock结扎夹脱离、异物排斥反应等问题依然存在。另外,目前临床常用的血管闭合设备在闭合血管时闭合时间过长、组织损伤大、烟雾多等方面的不足也促使外科医生对效率更高、组织损伤小、效果更稳定的止血设备的需求提高。随着腹腔镜胃、肠外科技术的发展,这种需求越来越迫切;另外,上述器械和设备对血管的闭合效果的可选择的安全性、范围和效率,仍未有相关比较数据。胃肠吻合术是腹部外科关键的核心技术,一旦发生吻合口漏或出血等,可能导致严重并发症,甚至危及患者生命。传统的胃肠道吻合方法如吻合器、手工缝合等在恢复胃肠系统连续性方面发挥重要作用。但是,技术不熟练的外科医生手工缝合胃肠道不仅花费大量的时间,而且会增加术后并发症的几率;吻合器虽然可以节约手术时间,但是也存在切割不完全、吻合不完整、组织易嵌顿、激发位置不当、激发后退出困难以及费用高等缺点,在整个胃肠消化道中的应用受到了限制。然而,在胃肠道吻合领域至今未见有创新性的成果。目前,国内、外在胃肠吻合方面主要使用吻合器、切割闭合器等离断闭合小肠,但费用高,不能重复使用。使用软组织高频焊接技术进行胃肠吻合在国内尚未报道,国际有文献报道,软组织高频焊接技术的应用设备HFEW-300PATONMED高频电子焊接仪能有效焊接家兔的脱落视网膜,我们的前期试验研究表明该设备能有效闭合动物(猪)离体小肠,该设备焊接的肠管与手工缝合比较,在爆破压、操作时间等方面具有一定优势。该设备能否有效闭合动物(猪)在体小肠未见报道。本研究将为通过在体试验研究活体软组织高频焊接技术能否有效焊接动物(猪)在体小肠,以及相关闭合操作技巧及焊接机制,为后续开展临床实验提供科学依据,为软组织高频焊接技术的验证和推广奠定基础。晚期胃癌患者如无明显梗阻症状,常以化疗为主。研究表明,代谢诱导微环境改变和非可控的炎症反应是促进胃癌发生、发展的重要因素。沃伯格效应(Warburgeffect)是由德国生物化学家奥托·沃伯格(OttoWarburg,1883～1970)于1930年发现,肿瘤细胞产生能量的方式极为特别:健康细胞依靠线粒体氧化糖类分子释放出较多的能量,而大多数肿瘤细胞则通过通过糖酵解方式释放少量能量为自身供能。研究表明,在缺氧条件下,HIF-1α通过激活糖酵解关键酶上调和氧化磷酸化的关键酶下调来增强Warburg效应,是调节肿瘤细胞适应缺氧微环境的关键转录激活因子。研究证实,细胞内高表达的HIF-1α可以促进肿瘤细胞异质化及肿瘤血管形成,导致肿瘤细胞发生浸润、转移。本研究证实迷迭香酸(RA)可通过有效抑制HIF-1α的表达,抑制MKN45细胞内的Warburg效应,促进MKN45胃癌细胞凋亡。STAT3在胃癌细胞中过表达,与肿瘤的发生有关。促炎细胞因子如IL-6,IL-1β,TNF-α等都是有效的STAT3活化剂。同时,肿瘤的存活、增殖和血管生成的有关基因是STAT3的下游靶点。本研究表明,迷迭香酸(RA)通过抑制miR-155-5p调控促炎细胞因子如IL-6,IL-lβ,TNF-α的表达,抑制IL-6/STAT3途径细胞通路作用于MKN45细胞内的Warburg效应。我们的研究表明miR-155是RA通过IL-6/STAT3通路抑制Warburg效应的目标靶点。同时在裸鼠移植瘤模型中证实:迷迭香酸(RA)能有效抑制MKN45细胞裸鼠移植瘤体内的Warburg效应。因此,迷迭香酸能有效抑制胃癌MKN45细胞的浸润和转移。第一部分:人体软组织高频焊接仪在闭合新西兰兔血管的有效性和安全性评价研究目的:1、通过比较新型高频电外科焊接系统(HFEW-300PATONMED)与ligasure(LS)、超声刀(HA)、手术丝线缝合(TL)等临床常用的血管闭合和组织分离方法,比较研究HFEW-300在闭合新西兰兔动、静脉的可行性、有效性和安全性;2、比较上述设备在闭合新西兰兔不同直径动、静脉过程中的操作时间、热损伤范围、血管闭合端爆破压、血管修复机制、组织病理学变化等方面的差异,评估HFEW-300PATONMED高频电外科焊接设备在闭合血管方面的性能。研究内容:1、比较研究HFEW-300闭合新西兰兔动、静脉血管后,血管闭合端的爆破压;2、探讨HFEW-300闭合新西兰兔血管过程中闭合处组织温度变化及闭合处周围血管热损伤范围;3、通过组织病理学检测和iNOS、eNOS mRNA测量来评估HFEW闭合新西兰兔后,闭合端血管愈合机制。研究方法:1、40只成年新西兰大白兔按随机数字表法分为A、B、C、D 4组,每组10只;A组:高频电外科焊接设备(HFEW-300PATONMED或HFEW-300),B组:超声刀(HA),C组:闭合束血管结扎系统(Ligasure或LS),D组:外科丝线缝合(TL)。新西兰兔术前24小时禁食,自由饮水,于耳缘静脉按每公斤体重5ml注射20%的乌拉坦溶液,麻醉成功后把实验兔固定在解剖台。60g/L硫化钠脱毛,碘酒、酒精常规消毒后取腹部正中切口长约8cm。打开腹腔后首先游离肠系膜上动脉、用游标卡尺测量血管的直径,按照分组用4种血管闭合方法闭合游离的胃短动脉血管,福禄克Ti25红外测温仪和NEC TVS-500EX红外摄像仪实时记录闭合处血管温度变化。焊接操作结束后,逐层缝合腹部切口,术中注意无菌原则;待麻醉清醒后,送回动物饲养房,观察动物生命体征,分别于术后24h、48h内耳缘静脉注射抗生素预防感染及补充10ml/kg电解质溶液。2、胃短动脉闭合后72h,通过耳缘静脉注射20%的乌拉坦溶液(5ml/kg)麻醉实验兔;麻醉成功后,把实验兔固定在试验台上。备皮、消毒后,沿腹部原切口打开腹腔,探查腹腔,大体观察闭合端血管情况,分离找到闭合胃短动脉的近心端,用4-0外科丝线距近心端断端2cm处结扎血管,切除断端血管,放置在福尔马林液体固定,行HE染色,观察血管闭合端愈合处炎症反应程度。同时,游离胃短动脉远心端断端,同法切除后,放置在5ml冻存管,保存在液氮罐中,利用实时荧光定量PCR技术(Real-Time PCR)测量不同血管闭合设备闭合血管后诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,iNOS)iNOS和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase,eNOS)eNOS mRNA 的表达情况,评测血管损伤后修复情况。3、常规备皮、消毒,分别依次分离实验兔双侧颈动、静脉血管,双侧股动、静脉血管,然后进入腹腔分离髂总动静脉及双侧肾动静脉、腹主动脉、下腔静脉等血管,依次使用4种不同结扎方法闭合血管,测量闭合时间和热损伤范围等。闭合完成后,闭合血管的另一端以恒定速度缓慢(10ml/min)注入生理盐水,直到血管破裂,测量血管破裂时的瞬间压力。闭合血管后,距离血管闭合端1cm处剪断血管,用40g/L甲醛缓释液固定,石蜡包埋,纵行及横行切片,苏木精和伊红染色,显微镜下观察闭合端血管组织融合程度、横向热损伤范围以及损伤的组织病理学改变。研究结果:1、HFEW-300组、LigaSure组、HA组和TL组分别结扎64个、57个、51个和59个动、静脉样本;血管直径方面,各组间比较无显著性差异(F = 0.876,P=0.456),多重比较表明HFEW-300组闭合新西兰兔血管的平均直径为2.97±0.79mm 与 LigaSure 组(3.21±1.07mm)、HA 组(3.18±1.03mm)和 TL 组(2.89±0.92mm)比较均无统计学意义;闭合时间方面,各组存在显著性差异(F=180.789,P = 0.000),多重比较结果表明HFEW-300组(8.54±1.26mm)闭合新西兰兔血管平均闭合时间大于LigaSure组(6.00±00mm,P=0.000),小于TL组(11.33±1.29mm,P=0.001),与 HA 组(9.03±1.72mm,P=0.441)无显著差别;2、闭合端血管平均爆破压方面,各组之间比较有显著性差异(F=32.882,P=0.000),多重比较结果表明:HFEW-300组(497.64±168.70mmHg)闭合新西兰兔血管后,闭合端血管平均爆破压大于LigaSure组(319.02±165.15 mmHg,P=0.000),小于 TL 组(616.20±155.93 mmHg,P=0.000),与 HA 组(488.25±228.60 mmHg,P=1)无显著差别;3、动脉血管比较方面,HFEW组、LigaSure组、HA组和TL组分别结扎32个、25个、24个和27个动脉血管样本;闭合端动脉血管平均爆破压方面,各组之间比较有显著性差异(F=39.641,P=0.000),多重比较结果表明HFEW-300组(507.03±157.60 mmHg)闭合新西兰兔动脉血管后,动脉血管平均爆破压显著大于 LigaSure组(308.24±155.52 mm Hg,P=0.000),小于 TL 组(701.19±103.41mmHg,P=0.000),与 HA组(500.50±188.07mmHg,P=1)无显著性差别。静脉血管比较方面HFEW-300组、LigaSure组、HA组和TL组分别结扎32个、32个、27个和32个静脉血管样本;静脉血管平均爆破压方面,各组之间比较有显著性差异(F=9.330,P=0.000);HFEW-300 组(488.25±181.15 mmHg)闭合新西兰兔静脉血管后,静脉血管平均爆破压显著高于LigaSure组(327.44±174.28 mm Hg,P=0.004),小于 TL 组(544.50±157.86mm Hg,P=0.008),与 HA 组(477.37±262.56mmHg,P=1)无显著性差异;4、LigaSure组,HFEW组,HA组闭合处周围血管2cm的最高温度分别为:87.20℃,99.73℃和131.25℃。各组热损伤范围之间存在显著性差异(F=451.292,P=0.000),多重比较表明HFEW-300组(3.04±0.57mm)闭合新西兰兔血管后热损伤范围小于 HA 组(5.54±1.22mm,P=0.000),大于 TL 组(0mm,P=0.000),与 LigaSure 组(2.77±0.94mm,P=0.367)无显著差别;5、按照血管直径大小进行分类分析:当对于闭合血管直径≥3mm方面,各组血管平均爆破压有显著性差异(F=7.016,P=0.000),多重比较方面HFEW组平均爆破压为 536.09 ± 220.16 mmHg 显著高于 LigaSure 组(326.70 ± 141.14mmHg),小于 TL 组(516.76±156.73mmHg),但与 HA 组(476.49±124.56mmHg)无显著性差异。对于缝合血管直径<3mm方面,各组血管平均爆破压有显著性差异(F=46.478,P=0.000),多重比较结果表明HFEW闭合直径小于3mm血管平均爆破压为 407.68±225.30mmHg,显著低于 TL 组(689.32±108.95mmHg)并高于Ligasure 组(310.48 ±190.74mmHg),但与 HA 组相比(536.09 ±220.165mmHg)并无显著性差异。图1-2中的误差棒为标准差。HFEW组、HA组、LigaSure组和TL组结扎胃短动脉72h后闭合端血管组织学病理切片结果显示HFEW组闭合端血管修复速度较快,焦痂已脱落;诱导型一氧化氮合酶(inducible nitricoxide synthase,iNOS)iNOS 和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase,eNOS)eNOS mRNA的表达情况在四组之间无显著性差异。研究结论:1、The HFEW、HA、LigaSure和TL均能有效、安全的结扎小于5mm的新西兰兔的血管;2、HFEW-300组闭合新西兰兔动、静脉血管后,闭合端动、静脉血管平均爆破压大于LigaSure组,小于TL组,与HA组无显著性差别;3、LigaSure组,HFEW组,HA组闭合血管处周围2cm的最高温度分别为:87℃,99℃和137℃,闭合处周围血管热损伤HFEW-300组小于HA组,大于TL组,与LigaSure组无显著差别;4、HFEW组闭合血管后产生的组织学损伤主要表现为:血管结构基本完整,闭合处血管组织紧密融合和组织玻璃样变性,无大面积局灶性坏死;72h后闭合端的血管结痂修复,iNOS和eNOS mRNA表达量与其余三组无明显差异;5、HFEW-300能有效的、安全的闭合新西兰兔在体动、静脉血管。第二部分:人体软组织高频焊接仪在闭合西藏小型猪在体血管的有效性和安全性评价研究目的:对比研究HFEW-300与HA、Ligasure和TL闭合西藏小型猪在体血管的可行性、安全性和有效性。研究方法:3只成年西藏小型猪的在体血管样本随机的分为4组,在体的实验猪小血管(1-3 mm)、中血管(4-5 mm)和大血管(5-11mm)按照实验前分组用4种血管闭合方法进行血管闭合;在体测量血管直径和爆破压;闭合处周围组织温度变化情况有Fluke Ti25进行测量。研究结果:1、4种血管闭合方法共计闭合42个动脉样本和82个静脉样本包括:腹主动静脉,颈动、静脉等血管。2、血管闭合时间方面,各组之间存在显著性差异(F=152.706,P=0.000),其中HFEW组(7.45± 1.64s)闭合血管时间大于LigaSure组(6.00±0.00s),小于HA 组(9.94±3.19s)和 TL 组(18.15 ±3.31s);3、血管直径方面,各组比较无显著性差异(F = 0.294,P= 0.830),多重比较结果表明:HFEW组,HA组,LS组和TL组闭合血管的平均直径无显著性差异,直径分别为:4.89±2.87mm,4.62±1.88mm,4.51±2.38mm,和 5.02±2.28mm;4、闭合血管后爆破压,各组存在显著性差异(F=13.688,P =0.000),多重比较结果表明:HFEW组闭合血管后爆破压(534.36±211.93mmHg)大HA组(391.50±184.00mmHg)和 TL 组(602.00±132.15mmHg)和 LigaSure 组(490.39±186.83mmHg)无显著性差异;5、动脉平均爆破压方面,各组比较有显著差异(F=22.952,P=0.000),静脉平均爆破压方面,各组比较亦有显著性差异(F=4.346,P=0.007);多重比较结果表明,HFEW组(534±184.00/455.09±100.66mmHg)闭合动、静脉平均爆破压大于HA组(391±125.37/319.70±125.37mmHg,P=0.011/P=0.014),小于 TL 组(749.44±99.92/602±132.15mmHg,P=0.000/P=0.008)与 The LigaSure(490.39±186.83/467.00±128.84mmHg,P=0.05/P=0.425)无显著性差异;6、闭合直径小于5mm血管时,各组平均爆破压有显著差异(F=7.599,P=0.000);HFEW组(548.00 ± 179.19mmHg)闭合血管后的爆破压大于HA组(416.86 ± 153.33mmHg,P=0.021)小于 TL 组(688.17 ±147.14 mmHg,P=0.011),与LigaSure组(513.95 ± 168.96mmHg,P=0.504)无显著性差异;闭合直径大于5mm血管时,各组平均爆破压有显著差异(F=5.295,P= 0.003),各组血管平均爆破压分别为HFEW组(337.83± 179.84 mmHg)闭合血管爆破压小于TL组(586.66±100.13mmHg,P = 0.032),与 HA 组(218.26± 172.59 mmHg,P = 0.061)和LigaSure 组(235.00 ± 159.69mmHg,P = 0.963)无显著性差异。研究结论:1、HFEW-300闭合西藏小型猪在体血管样本的平均时间小于TL和HA,大于LS;2、HFEW闭合西藏小型猪的在体血管的爆破压显著高于HA,低于TL,但与LigaSure无显著性差异;3、HFEW、HA、LigaSure和TL均能有效的闭合西藏小型猪在体动脉血管,且闭合后血管的爆破压均高于实验猪的正常血压;4、HFEW、HA、LigaSure和TL均能有效的闭合西藏小型猪在体静脉血管;5、The HFEW闭合西藏小型猪的在体动静脉血管的爆破压大于HA,小于TL,与LS无显著性差异;6、HFEW是可安全、有效的闭合西藏小型猪在体7mm以下的血管;7、HFEW闭合血管过程中闭合处对周围组织温度影响较小。第三部分:人体软组织高频焊接仪在闭合西藏小型猪在体小肠的有效性和安全性评价研究目的:HFEW-300与外科丝线缝合对比研究闭合西藏小型猪在体小肠的可行性、安全性和有效性。研究方法:3只成年西藏小型猪,体重分别为:48.5Kg,49.2Kg和50.3Kg;按随机数字表法分为A、B、C3组,每组1只。术前12h禁食、6h禁水,术前24h常规添加泻药番茄叶喂食试验猪,做好术前胃肠道准备;待麻醉显效后,常规固定实验猪、消毒、铺巾,取腹部正中切口打开腹腔,充分暴露小肠,在回盲部开始切断小肠与回肠,沿近端小肠每10cm随机使用HFEW-300的weld-1模式和外科丝线单纯、间断缝合肠管,红外测温仪测量焊接时焊接点温度,连接三通管的压力计持续测量肠管内压力,注射泵以10ml/min的恒定速度向肠管内注入气体,压力计测量闭合端肠管破裂时的瞬时肠管内压力,焊接处闭合肠管的远端石蜡包埋后送常规病理检测,评价创面炎性反应及组织融合情况。研究结果:1、外科全层连续缝合组和HFEW-300组分别闭合小肠样本48个,两种方法均能有效的闭合猪在体小肠,成功率均为100%;其闭合小肠后的瞬时爆破压分别为:(136.19 mmHgvs 75.83 mmHg),两组之间的差异有统计学意义(t = 10.067,P=0.000);2、外科全层连续缝合组和HFEW-300组分别闭合小肠时间分别为:(285.12 ±52.24)s和(108.79 ± 30.82)s,两组之间的差异有统计学意义(t=20.141,P =0.000);3、HFEW-300组分别闭合小肠后组织病理学改变主要是急性热损伤和压力损伤。研究结论:1、HFEW-300能安全、有效的闭合西藏小型实验猪的在体小肠;2、HFEW-300闭合西藏小型猪在体小肠的闭合时间少于外科丝线缝合;3、HFEW-300闭合西藏小型猪在体小肠后,闭合处肠管病理组织学主要表现为:闭合端肠管组织焊接严密、牢固,局部有玻璃样坏死。第四部分:迷迭香酸通过miR-155抑制Warburg效应促进胃癌细胞凋亡研究目的:Warburg效应是指大多数肿瘤细胞在有氧条件下,利用产能率相对较低糖酵解作用产生ATP,为自身提供能量。慢性炎症因子在Warburg效应中发挥重要作用。我们的前期研究已证实迷迭香酸能有效促进胃癌细胞凋亡的作用,本研究拟通过体内、外试验证实迷迭香酸(RA)是否通过拮抗胃癌细胞内的Warburg效应来促进胃癌细胞凋亡。同时,我们将进一步研究迷迭香酸(RA)对Warburg效应的拮抗作用机制。研究方法:MTT法体外检测MKN45细胞生长情况。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MKN45细胞内促炎细胞因子的释放。RT-PCR检测细胞内micRNA的表达水平。Western blotting印迹法检测MKN45细胞内蛋白的表达情况。建立裸鼠MKN45细胞异植瘤模型,体内检测迷迭香酸(RA)抗Warburg效应促进肿瘤细胞凋亡的作用。研究结果:我们的研究证实,迷迭香酸(RA)能通过抑制MKN45细胞内葡萄糖的摄取和促进乳酸产生,有效抑制Warburg效应。同时,RA通过抑制转录因子HIF-1α的表达,影响MKN45细胞内糖酵解途径。迷迭香酸(RA)可以抑制促炎性细胞因子和micRNA的表达进而抑制肿瘤细胞Warburg效应,这表明迷迭香酸(RA)通过抑制IL-6/STAT3途径等细胞通路作用于MKN45细胞内的Warburg效应。miR-155被认为在炎症和促进肿瘤发生的重要介质。本研究进一步证实了miR-155可通过抑制IL-6/STAT3通路来调节Warburg效应的靶基因,同时我们也证实迷迭香酸(RA)能抑制MKN45细胞裸鼠移植瘤体内的Warburg效应。研究结论:1、本研究证实了 RA通过抑制胃癌MKN45肿瘤细胞Warburg效应促进细胞凋亡;2、RA通过抑制转录因子HIF-1 α的表达抑制MKN45细胞葡萄糖摄取和乳酸生成的作用,作用于MKN45细胞的Warburg效应;3、RA可以抑制促炎性细胞因子和炎症相关microRNA(miR-155)的表达,通过IL-6/STAT3细胞通路,调节炎症反应抑制Warburg效应;4、RA可以在裸鼠体内抑制MKN45细胞的Warburg效应。