论文部分内容阅读
解旋酶是一类依赖能量底物水解沿核酸底物特定方向移动并打开碱基之间氢键的酶。生命体中许多重要生化反应过程的进行常常伴随解旋酶的参与调节。Pif1解旋酶家族是依赖ATP水解供能并沿DNA5’-3’方向解旋的解旋酶,Pif1解旋酶自首次被发现就受到广泛关注,它在端粒、线粒体DNA的复制和冈崎片段的加工成熟过程中扮演重要角色。更为重要的是Pif1解旋酶与撞击端粒酶实验已经在体内体外被验证,从这方面可能开拓一个新途径来抑制肿瘤的端粒酶的活性从而治愈肿瘤。因此Pif1解旋酶的深入研究不仅对研究生物进化更对人类疾病的研究与控制有重大意义。本研究以一种嗜热的厌氧棒菌Anaerobaculum hydrogeniformans DNA解旋酶Pif1(Ana Pif1)为材料,利用蛋白原核表达系统获得高纯度Ana Pif1蛋白,利用stop-flow以及DLS等技术对其解螺旋活性和聚集状态进行分析,以期拓展人们对于原核生物Pif1解旋酶家族的认知,主要获得了以下结果。1)通过对AnaPif1解旋酶表达基因的修饰将其与sumo促溶标签一起重组构建入pET15b载体中,形成重组载体pET15b-sumo-AnaPif1,经鉴定后得到的表达载体可在表达菌株中BL21(DE3)中大量表达,可溶性良好。2)含有大量目的蛋白的细胞破碎上清液经Ni-NTA亲和层析,Sumo酶切,Heparin柱盐粒子梯度洗脱可得到纯度(95%)极高的目的蛋白。分子量大小为55kDa,等电点6.89。3)AnaPif1最佳解旋条件摸索时针对pH条件、Tris、NaCl、MgCl2和DTT浓度等条件对解旋活力的影响来确定最优条件。最终实验发现除DTT外其余条件对AnaPif1解旋酶活力均有不同程度的影响,在pH为7.0的20mmol/L Tris缓冲液中其解旋时间常数最大(1.2 s-1),盐离子浓度(Na+和Mg2+)也会强烈影响蛋白活,20mmol/L NaCl、2mmol/L MgCl2其解旋活性最佳。因此最佳的解旋条件为:Tris-HCl(pH 7.0)20 mmol/L、NaCl 20 mmol/L、MgCl2 2 mmol/L4)由于AnaPif1解旋酶是嗜热菌蛋白,它的最佳解旋活力的发挥肯定需要特定的温度调节。在最佳buffer条件(Tris-HCl(pH 7.0)20 mmol/L、NaCl 20 mmol/L、MgCl2 2mmol/L)下设置一系列温度梯度(25-50℃),发现AnaPif1解旋酶的解旋活力强烈依赖于温度的变化,过高或过低的温度其活性都会受到不同程度的抑制。37℃为其最佳解旋温度此时的反应时间常数可达2.4 s-1。5)在探索AnaPif1解旋酶最佳能量供体时发现该蛋白可利用四种核苷三磷酸水解产生的能量来完成解旋反应,但对每种NTP的利用效率不同,蛋白对于ATP的利用效率最高,解旋反应速率可达到1.4 s-1,解旋比例也达到约50%。相比之下,该酶在利用其它三种核苷三磷酸(GTP/UTP/CTP)时,解旋速率以及幅度都较差。这说明AnaPif1解旋酶可以利用多种核苷三磷酸作为能量供体以完成DNA底物的解旋反应,但是其最佳的能量供体为ATP。6)针对26 nt-17 bp、50 nt-16 bp、26 nt-3G4-17 bp这三种底物的活性实验可以看出AnaPif1解旋酶对于双链DNA和G4-DNA的解旋活性相差不大,不管是从解旋速率(三者均在0.95-1.10 s-1之间)还是解旋比例(三者均在40-50%之间)来讲都非常接近。这就说明AnaPif1解旋酶不像酵母Pif1那样能够被G4-DNA所激活,这一点与细菌Pif1相类似。7)利用DLS技术研究蛋白聚集状态时发现,在最佳解旋溶液条件下AnaPif1解旋酶的蛋白颗粒半径为3.4nm,分子量大小为60kDa,说明在此条件下蛋白以单体形式存在没有发生类似酵母Pif1的二聚状态,与细菌Pif1更类似。