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研究背景:急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是多种因素引起的,以肺部微血管和肺泡上皮弥漫性损伤、肺水肿及肺间质纤维化等为病理特征的临床综合症,严重者可发展为急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。由于ALI/ARDS发生机制较为复杂且具有较高死亡率,目前尚无特异有效的防治方法和药物。所以研究ALI/ARDS发生机制,研究有效治疗药物是该领域的重要研究方向。蛇床子素(Osthole,Osth)具有多种生物活性,如抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗凋亡等,已经被众多学者所关注。近年来,许多文献已经报道Osth具有抗氧化和抗炎的作用,但有关Osth对脂多糖引起的ALI的保护作用及其机制研究的尚鲜见报道。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是ALI/ARDS的常见致病因素之一。大量实验证明,LPS参与激活体内的活性氧簇(reactive oxygenspecies,ROS)从而引发体内氧化应激(oxidative stress,OS)。在氧化抗氧化的系统中,核因子相关因子(Nuclearfactor erythroid-2related factor2,Nrf2)可以调节硫氧还蛋白1(thioredoxin1,Trx1)等多种抗氧化蛋白,同时Trx1起到了清除ROS及氧化还原的重要作用。有研究表明Osth具有抗氧化作用,那么Osth在LPS诱导的ALI中是否通过Nrf2和Trx1清除ROS从而发挥保护ALI的作用仍不明确。本实验拟观察Osth对LPS所致小鼠ALI的预防及其治疗作用和对细胞OS损伤的保护作用,并进一步研究其发挥作用机制。实验目的:(1)观察Osth对LPS导致小鼠死亡率的影响。(2)观察Osth对LPS诱导的ALI的防治作用。(3)观察Osth是否通过Nrf2/Trx1通路减轻ALI。实验方法:动物实验为了观察Osth对小鼠死亡率的影响,将雄性小鼠(18-23g)随机分为三组:Control组(n=20),LPS组(n=20)及Osth+LPS组(预防组,n=60)。腹腔注射50mg/kg LPS成功建立小鼠内毒素血症模型,在Osth+LPS组分别给予Osth(20,40或80mg/kg),连续三天,每天一次。然后给予腹腔内注射LPS后,每12h记录一次小鼠的死亡情况,连续72h。雄性BALB/c小鼠(18-23g)适应环境后,随机分为五组:对照组(n=10),Osth组(n=10),LPS组(n=10),Osth+LPS组(n=30),LPS+Osth组(n=30)。LPS组气管内滴注LPS建立小鼠肺损伤模型。在对照组,Osth组与Osth+LPS组,分别以生理盐水和Osth(40mg/kg)灌胃三天,每天一次。然后在LPS组,Osth+LPS组和LPS+Osth组,分别给予LPS(5mg/kg)气管内滴注。LPS+Osth组在气管内滴注LPS后1h给予灌胃Osth(40mg/kg)。在LPS处理6h后取小鼠肺组织进行检测和观察。测定肺湿重/干重比值(W/D)、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中蛋白含量,肺组织匀浆中检测过氧化氢(hydrogenperoxide,H2O2),羟自由基(hydroxylradical, OH)和丙二醛(Methane Dicarboxylic Aldehyde,MDA)。Western blot检测Nrf2和Trx1的蛋白含量。细胞实验培养A549细胞系,在培养到对数生长期时进行传代。用Osth(0,25,50或100μg/ml)处理A549细胞,2h后部分细胞被LPS(1μg/ml)刺激12h,取细胞上清液检测LDH含量。将A549细胞接种到96孔板中,处理同上所述,然后使用MTT法检测A549细胞活力。为了证明Osth是否通过Nrf2/Trx1来清除ROS,从而发挥保护作用。将A549细胞接种于6cm细胞培养皿中,加入Nrf2siRNA和50μg/ml Osth,共同培养2h后加入1μg/ml的LPS,检测LDH和细胞活力。RT-PCR检测Nrf2和Trx1的mRNA和蛋白表达,并用流式细胞术检测细胞内ROS含量。实验结果:动物实验Osth对LPS导致的小鼠死亡率的影响:20,40或80mg/kg Osth预处理组的小鼠72h死亡率分别为:80%,45%和40%,比LPS组的累计死亡率(85%)均有降低,并且在40,80mg/kg的Osth+LPS组72h累计死亡率明显降低,具有统计学差异(P<0.05)。肺组织病理结果表明:在LPS组肺组织充血、水肿明显,有大量炎症细胞浸润,并存在大面积肺不张。而在Osth+LPS组和LPS+Osth组LPS导致的肺损伤明显减轻;LPS组W/D、BALF中蛋白含量均比对照组明显升高(P<0.05),但是在Osth+LPS组和LPS+Osth组上述两个指标均较LPS组明显降低(P<0.05)。LPS组的肺组织匀浆中H2O2, OH,MDA含量明显高于对照组(P<0.05),而在LPS+Osth组和Osth+LPS组,三者的含量明显低于LPS组有统计学差异(P<0.05)。Western Blot结果显示:LPS组的Nrf2和Trx1的蛋白含量显著低于对照组,而Osth+LPS组和LPS+Osth组中Nrf2和Trx1的蛋白含量显著高于LPS组,具有统计学差异(P<0.05)。细胞实验LPS增加A549细胞上清液中的LDH含量,而Osth可浓度依赖性的抑制LPS导致的LDH含量增加。MTT分析结果显示:单独Osth处理组对细胞活力没有影响,1μg/ml的LPS显著降低A549细胞活力,Osth浓度依赖性的减轻LPS诱导的细胞活力下降。LPS可以显著增加LDH和细胞内ROS的含量,并显著降低细胞活力。然而,Nrf2和Trx1的mRNA和蛋白含量被明显下调。给予Osth后的LPS组LDH和细胞内ROS被抑制。与此同时,细胞活力、Nrf2和Trx1的mRNA和蛋白表达均增加。Nrf2siRNA后Nrf2和Trx1的mRNA和蛋白表达降低。Nrf2siRNA+Osth+LPS组中LDH和ROS的含量比Osth+LPS组的增加,细胞活力增加。因此,Nrf2siRNA可以下调Nrf2/Trx1的表达,同时逆转Osth对细胞损伤的保护作用。结论:(1) Osth明显降低LPS导致的小鼠死亡率。(2) Osth对LPS导致的小鼠ALI具有预防和治疗作用。(3) Osth可能通过上调Nrf2和Trx1起到防治LPS诱导的ALI的作用。