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目的:
建立一种简单经济能够检测人体时钟基因启动子区甲基化水平的方法,检测帕金森病患者与正常老年人外周血白细胞基因组DNA时钟基因启动子区甲基化水平,比较二者之间的差别,探讨帕金森病患者时钟基因异常表达的机制。
方法:
针对七种时钟基因(per1、per2、cryl、cry2、clock、npas2、bmall)启动子区设计两套甲基化特异性聚合酶链式反应(Methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)引物,每套MSP引物包含一对甲基化特异性引物(M)和一对非甲基化特异性引物(U)。建立时钟基因启动子区MSP法,SssI甲基转移酶(NewEnglandBiolabs,UK)处理的基因组DNA作为阳性对照,未经偏重亚硫酸盐处理的基因组DNA作为阴性对照。将SssI甲基转移酶处理的基因组DNA与仅用亚硫酸氢盐处理的DNA采用以下几种比例混合,1:1、1:3、1:9、1:99混合来检测检出甲基化的灵敏度。最后对PCR产物进行直接测序和电泳鉴定。并检测206例帕金森病患者(122例男性,84例女性)和181例正常老年对照(103例男性,78例女性)的七种时钟基因启动子区甲基化水平。
结果:
成功建立了简单经济的人体时钟基因(per1、per2、cryl、cry2、clock、npas2、bmall)启动子区甲基化的检测方法并检测了206例帕金森病患者(122例男性,84例女性)和181例正常老年对照(103例男性,78例女性)的七种时钟基因启动子区的甲基化水平。七种时钟基因中,帕金森病患者与正常老年对照cryl和npas2启动子区存在明显甲基化,另五种时钟基因(per1、per2、cry2、clock、bmall)启动子区未发现明显甲基化。另外,与正常老年对照相比,PD患者npas2甲基化频率明显下降。
结论:
帕金森病患者患者时钟基因npas2启动子区与正常老年人相比甲基化程度降低。PD患者时钟基因的异常表达可能与时钟基因启动子区甲基化的改变有关。