【摘 要】
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正常构象朊蛋白(PrPC)错误折叠后成为朊病毒(PrPSc),这个构象转变过程被认为是朊病毒疾病最基本的致病因素,但其潜在的分子机制至今仍不清楚。PrPC是一种利用C端磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol anchor,GPI anchor)锚定于神经细胞膜“脂筏”区(Lipid raft),并广泛表达的糖蛋白。已知PrPC与细胞膜脂质体有相互作用,该作用能改变Pr
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正常构象朊蛋白(PrPC)错误折叠后成为朊病毒(PrPSc),这个构象转变过程被认为是朊病毒疾病最基本的致病因素,但其潜在的分子机制至今仍不清楚。PrPC是一种利用C端磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol anchor,GPI anchor)锚定于神经细胞膜“脂筏”区(Lipid raft),并广泛表达的糖蛋白。已知PrPC与细胞膜脂质体有相互作用,该作用能改变PrPC结构的稳定性。近期研究表明,朊蛋白近N端阳性电荷区(23-28氨基酸位点,CC1)可以促进朊病毒疾病的发展;而以不同株系的野生型朊病毒感染八肽重复区(51-90氨基酸位点,OR)敲除的转基因鼠,会造成宿主两极化的朊病毒疾病发病进程,例如RML-prion会促进敲除鼠的疾病进程,而BSE-prion则延缓疾病进程;因此本文将从上述的两个蛋白质区域着手,探讨朊蛋白N端与脂质体的相互作用对构象转变的影响,以及对朊病毒疾病发生发展的影响。为了探索CC1区在朊蛋白构象转变过程中所起的作用,我们首先制备两种CC1区的重组朊蛋白(recombinant PrPC,rec PrPC),其中之一是移除该区域氨基酸序列上全部正电荷的Met4-1突变体,另一种则是删除该区域全部氨基酸序列的ΔN6突变体。通过不同的体外生物实验测定,我们发现相较于WT的构象转变能力,Met4-1及ΔN6这两种突变体的转变能力下降,但均能形成蛋白酶K(PK)抗性构象(r PrP-res),且所有rec PrPSc对野生型小鼠C57BL/6j均具有致病性,造成100%小鼠死亡率;但相较于WT-rec PrPSc诱导的致病小鼠,ΔN6-rec PrPSc显著地延长了小鼠生存期,而Met4-1-rec PrPSc却显著地缩短了生存期,这种不一致的现象很可能是因为三种rec PrPSc各自有不同的构象,从而导致不同的传播与神经毒性模式。其次,我们藉由分析在rec PrPC构象转变过程中CC1区与阴离子脂质体(POPG)的相互作用,证明了CC1区主要通过增强静电作用力与POPG相互作用,促进PrP构象转变;因此CC1区在疾病中可能扮演促进PrP构象转变,加重神经病理损伤的角色。为了进一步了解OR区在朊蛋白构象转变过程中所起作用,我们制备了OR区氨基酸序列全删除的重组朊蛋白ΔOR突变体。通过一轮sPMCA体外扩增,WT-和ΔOR-rec PrPC均能被诱导为具PK抗性的r PrP-res,相较于WT的构象转变能力,ΔOR的转变能力显著上升。其次,我们利用CRISPR-Cas9技术构建的Prnp-ΔOR+/-小鼠自交后代进行朊病毒疾病造模后,发现随着小鼠PrPC-ΔOR表达量逐渐递增(WT<Heter<ΔOR),其朊病毒疾病模型小鼠的生存期越长,脑组织中PrPSc沉积越少以及神经损伤越轻。接着我们分析在rec PrPC构象转变过程中OR区与阴离子脂质体(POPG)的相互作用,发现OR区主要通过减弱疏水作用力与POPG相互作用,阻碍PrP构象转变;藉此产生构象转变效率下降但却有更强神经毒性的PrPSc。本研究的实验结果阐明了CC1区和OR区在PrPC转变为PrPSc中扮演了不同的角色,也为朊病毒致病进程的分子机制提供了崭新的思路。
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