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SOX2作为一种重要的转录因子,在胚胎干细胞的干性维持和早期分化、IPS细胞的诱导以及很多基因的激活或抑制中均起着至关重要的调控作用。同时SOX2的表达异常与许多疾病的发生有关,并参与多种肿瘤的发生与发展。通过对SOX2基因表达调控的研究可以发现一些能够影响SOX2基因表达的相关基因及小分子药物,这些基因及小分子药物的发现将对SOX2基因功能的进一步阐明及SOX2基因的应用研究起到极大的推动作用。目前检测基因的调控表达主要是通过RT-PCR或者将目标基因启动子克隆到携带报告基因的检测表达载体中等手段来实现。RT-PCR过程繁琐且不稳定,不利于高通量筛选；由于基因组本身存在表观遗传学修饰,将启动子克隆到携带报告基因的表达检测载体中的方法无法模拟基因组的真实状态,因此难以准确反映基因组上启动子活性的变化。基因组靶向编辑技术的出现,使基因组的精确修饰成为可能。目前最为常用的三种基因组靶向编辑技术为锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)以及CRISPR/Cas (cluster regulatory interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated proteins)等。它们的识别机制,组装方法,特异性等方面互不相同。其中,锌指核酸酶是最早出现的一种基因组编辑核酸酶,但由于其组装复杂,筛选成功率低,有脱靶效应,现在已经较少应用。与ZFN相比,TALEN具有组装相对容易、筛选成功率高、特异性强及切割活性高等特点。此外,CRISPR/Cas系统构建极其方便,实验周期短,但由于该系统对靶基因的识别是基于一小段sgRNA与靶基因之间的碱基配对来实现的,因此可能存在一定的脱靶风险。本课题将分别采用TALEN介导的靶向基因插入技术和CRISPR/Cas介导的转录激活技术建立并测试SOX2P-Luciferase及SOX2P-SOX2-T2A-Luciferase细胞系。研究内容整体上可分为两大部分：一方面采用TALEN介导的靶向基因组修饰技术,分别在基因组上SOX2基因启动子下游及SOX2基因3’端整合入一个敏感的荧光素酶报告基因,建立两种可用于研究SOX2基因表达调控的SOX2P-Luciferase及SOX2P-SOX2-T2A-Luciferase细胞系；另一方面为了验证所建立的细胞系的敏感性和准确性,我们建立了基于CRISPR/Cas技术的高效的转录激活系统,并使用该系统对所建立的SOX2P-Luciferase及SOX2P-SOX2-T2A-Luciferase细胞系内的SOX2启动子进行转录激活及检测,并验证所建立的两种细胞系中的Luciferase的激活水平与内源性SOX2基因激活水平一致。两种细胞系的建立将为SOX2基因的表达调控、SOX2基因相关的信号通路、肿瘤治疗以及IPS细胞的诱导等研究提供一种新的工具,在医学及产业应用方面具有巨大潜力。本课题的具体研究内容如下：(1)靶向SOX2基因的’TALENs核酸酶的设计、组装及活性检测。根据对SOX2基因内源性启动子进行表达调控研究的需要,分别设计两种不同的基因打靶策略。一种是将Luciferase报告基因直接整合于SOX2基因内源性启动子之后,当报告基因插入相应位点后,替换了SOX2基因,破坏了该条染色体上SOX2分子的表达；另一种是将Luciferase报告基因插入到SOX2基因C端,使用SOX2基因启动子表达SOX2-T2A-Luciferase融合蛋白后通过自剪切小肽T2A剪切为两个独立的蛋白SOX2和Luciferase,该策略在不破坏SOX2分子本身表达的同时还可以表达报告基因。为了达到以上目的,通过查询SOX2基因结构及其启动子序列,我们利用ZiFiT软件在SOX2基因上选择了四个位于不同位置的TALENs靶位点,并依据靶位点处的基因组序列将TALE重复单元依次串联组装获得完整TALEs。经测序正确之后,将TALE分别连接到FokI核酸酶的N端,形成TALE-FokI融合基因,即TALEN。再将构建好的TALENs核酸酶表达载体分别转染HEK 293细胞系,使用T7 El assay方法检测TALEN核酸酶的切割活性。由此所获得的具有良好生物学切割活性的TALENs将用于上述两种打靶策略的实施。(2)靶向SOX2基因的两种打靶载体的构建。依据Luciferase报告基因的插入位置及成功筛选出的TALEN核酸酶的作用位点,分别设计可在SOX2基因启动子下游及SOX2基因C端插入荧光素酶报告基因的两种不同打靶载体。用于在SOX2基因启动子下游插入报告基因的打靶载体,其上游同源臂终止于SOX2基因起始密码子ATG之前,在上游同源臂之后直接插入Luciferase报告基因,在此之后插入正筛选元件CMV-eGFP-T2A-Neomycin-SV40pA。同时,为了方便建系后期对非特异性随机整合的细胞进行剔除,在打靶载体下游同源臂以外连接负筛选元件PGK-TK-T2A-mCherry-SV40pA,最终获得第一种打靶载体。而用于在SOX2基因C端插入报告基因的打靶载体,其上游同源臂终止于SOX2基因终止密码子TGA之前,在上游同源臂之后直接连接T2A自剪切小肽,隔开SOX2基因与Luciferase基因,使用SOX2基因启动子同时调控表达SOX2与Luciferase,载体其余部分同第一种打靶载体,最终获得第二种打靶载体。使用该两种打靶载体用于后续相应细胞系的建立。(3) SOX2P-Luciferase及SOX2P-SOX2-T2A-Luciferase细胞系的建立。分别使用成功筛选的靶向不同位点的TALENs表达载体及各自对应的打靶载体共转HEK293细胞,再分别使用G418及GCV两种药物进行筛选,并对筛选后细胞经有限稀释法进行克隆化,再对克隆化后细胞通过PCR的方法进行初步鉴定,并对其中阳性克隆进行进一步测序及Southern Blot检测,证实携带荧光素酶报告基因的打靶载体在两个靶位点处的正确重组,最终获得单一稳定的SOX2P-Luciferase及SOX2P-SOX2-T2A-Luciferase细胞系。(4)设计并构建靶向SOX2基因启动子区域用于转录激活的sgRNA的表达载体。根据NCBI查得SOX2基因的启动子序列,依据sgRNA设计原理选择7个sgRNA识别靶位点,合成对应引物,分别退火形成sgRNA1-7,并与sgRNA表达载体连接,测序正确最终获得SOX2 sgRNA1-7表达载体。该系列sgRNA表达载体将被应用于SOX2基因的转录激活实验研究。(5)建立CRISPR/dCas介导的高效的转录激活系统。通过PCR克隆VP64,P65及HSF1三个转录激活相关基因,然后分别构建dCas9-VP64融合基因表达载体及MS2-P65-HSF1融合基因表达载体；最后构建sgRNA2.0表达载体,其骨架的突出环状部分插入了一段RNA适配体序列,该序列可与MS2蛋白特异性结合。将上述构建的包含转录激活相关基因的表达载体与sgRNA表达载体共同使用即可组成转录激活系统,使用该转录激活系统在载体水平对靶基因进行转录激活测试,并探讨靶向多个不同位点的sgRNA的串联使用对靶基因的转录激活效果。(6)验证SOX2P-Luciferase及SOX2P-SOX2-T2A-Luciferase细胞系中Luciferase表达变化是否可以真实反映SOX2基因的相对表达量及表达变化。使用所建立的转录激活系统分别转染SOX2P-Luciferase、SOX2P-SOX2-T2A-Luciferase及HEK293细胞系,并对SOX2P-Luciferase及SOX2P-SOX2-T2A-Luciferase细胞系中的Luciferase活性及HEK293细胞系中SOX2分子的mRNA表达水平分别进行检测。通过对两种knock-in细胞系中的Luciferase表达活性与HEK293细胞中的SOX2 mRNA表达水平及表达变化的比较,进一步验证SOX2P-Luciferase及SOX2P-SOX2-T2A-Luciferase细胞系中Luciferase活性是否可以准确反映SOX2分子的相对表达变化。综上所述,本课题首次采用TALEN核酸酶技术分别在基因组上SOX2基因启动子下游及SOX2基因的3’端原位整合入Luciferase报告基因,建立了SOX2P-Luciferase及SOX2P-SOX2-T2A-Luciferase两种knock-in细胞系,并多方面验证了两种细胞系中外源基因在基因组上的定点整合。同时利用CRISPR/dCas技术构建了高效的转录激活系统,使用该系统分别对SOX2P-Luciferase及SOX2P-SOX2-T2A-Luciferase细胞系进行转录激活,结果表明SOX2P-Luciferase及SOX2P-SOX2-T2A-Luciferase细胞系内的Luciferase表达水平可以准确灵敏地反映细胞系内SOX2分子表达水平。两种细胞系的建立将有助于SOX2基因功能研究及筛选影响SOX2表达的小分子化学药物,为肿瘤治疗和IPS.相关研究提供一种新的实验思路及解决方案。同时,本课题中所建立的通过在靶基因下游整合入报告基因来监测靶基因表达的方法也可广泛应用于其它各种基因的相关研究。