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文章分为两部分进行阐述 第一部分 18F标记新型RGD二聚体(18F-RGD2)探针构建及其在SKOV-3卵巢癌荷瘤鼠靶向显像中的应用研究 目的： 本论文合成一种新型18F标记聚乙二醇修饰的RGD探针18F-FB-NH-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2（记为18F-RGD2），并研究了其在人卵巢癌SKOV-3荷瘤鼠模型中靶向肿瘤显像及监测抗血管生成药物疗效的作用及意义。 方法： 1、制备探针18F-RGD2 将纯化的18F-SFB溶于DMSO，然后添加NH2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(RGD2)的DMSO溶液和DIPEA，60℃加热30 min，产物用Sep-Pak C-18柱进行纯化，并应用radio-HPLC检测放化纯。 2、建立荷瘤鼠模型 选取4-6周龄的雌性裸鼠，左肩皮下注射含5×106个SKOV-3卵巢癌细胞的生理盐水溶液，操作在通风的无菌条件下完成，建模后进行常规饲料喂养。肿瘤大小约50 mm3时进行生物学分布研究。 3、生物学分布研究及阻断实验 荷瘤鼠尾静脉注射1MBq/0.1ml18F-RGD2，30min、60min、120min后分批处死小鼠。采集肿瘤、血液、肌肉、骨、心脏、肝脏、肺、肾脏、肠等重要组织和器官，称重后，用γ计数器进行放射性计数，计算％ID/g。 阻断实验:另选SKOV-3荷瘤小鼠，每只尾静脉同时注入1 MBq/0.1 ml剂量的18F-RGD2和过量未标记的E[c(RGDfK)]2，60min后处死小鼠，进行生物学分布研究。 4、MicroPET显像 两组SKOV-3荷瘤鼠分别注射3.7 MBq/0.1 ml18F-RGD2或者5 MBq/0.1ml18F-FDG，60min后，腹腔内注射0.6％戊巴比妥钠，麻醉后行MicroPET扫描，扫描模式为静态采集5 min。 5、紫杉醇治疗方案 将紫杉醇溶于DMSO后用PBS缓冲液稀释到所需浓度。将实验小鼠分为治疗组和对照组，每组12只。治疗组给予0.1ml的紫杉醇(10 mg/kg)，对照组给予0.1ml的PBS溶液，每3天给药一次，连续给药6次。 6、免疫组织化学分析 将生物学分布研究中处死小鼠的肿瘤组织做免疫组织化学分析。将肿瘤组织4％多聚甲醛固定后，制备成石蜡切片，利用抗CD34抗体进行免疫组织化学染色，定量分析肿瘤的微血管密度。 结果： 1、成功合成新型18F标记RGD探针18F-RGD2。 2、生物学分布研究结果表明18F-RGD2在SKOV-3肿瘤组织明显浓聚，肿瘤靶向性好。 3、MicroPET显像证实18F-RGD2在卵巢癌组织明显聚集，18F-RGD2的T/NT(靶/非靶)比值明显大于18F-FGD的T/NT比值。 4、抗肿瘤血管生成治疗后，治疗组的肿瘤18F-RGD2摄取低于对照组，注射后60 min降低31.31％±7.18％(P=0.009)，注射后120 min降低38.92％±8.31％(P＜0.001)。 5、免疫组化染色证实SKOV-3肿瘤组织高表达CD34，紫杉醇抗血管生成治疗后肿瘤组织CD34表达下降，微血管密度降低，与生物学分布结果一致。 结论： 18F-RGD2具有较强的整合素αvβ3亲和力，在肿瘤组织明显浓聚，可用于抗肿瘤血管生成疗效监测和评价。 第二部分 99mTc-3PRGD2监测不同抗肿瘤血管生成药物疗效的差异性研究 目的： 尝试通过利用目前比较成熟的放射性探针99mTc-3PRGD2，研究RGD多肽类探针监测不同抗肿瘤血管生成药物治疗疗效的有效性，并探讨其在监测不同抗肿瘤血管生成药物疗效中是否存在差异性及分子机理。 方法： 1、制备探针99mTc-3PRGD2 99mTc-3PRGD2通过HYNIC-3PRGD2药盒制备。将1ml99mTcO4-溶液(25mCi)加入到HYNIC-3PRGD2药盒中，震荡，溶解充分后100℃水浴加热20min，室温冷却5 min后放射性薄层纸层析法检测放化纯。 2、建立荷瘤鼠模型 选取4-6周龄的雌性裸鼠，左肩皮下注射含5×106个SKOV-3卵巢癌细胞生理盐水溶液，建模操作在通风的无菌条件先完成。建模后进行常规饲料喂养。肿瘤大小约50 mm3时进行生物学分布研究。 3、抗血管生成治疗方案 将紫杉醇和夫拉平度用DMSO溶解，然后用PBS缓冲液稀释到所需浓度。将24只荷瘤鼠随机分为紫杉醇组、夫拉平度组和对照组，每组8只。紫杉醇组每次腹腔内注射0.1ml紫杉醇溶液(20mg/kg)，夫拉平度组每次腹腔内注射0.1ml夫拉平度溶液（5mg/kg），对照组裸鼠每次腹腔内注射0.1 mlPBS缓冲液。每3天注射一次，共注射6次。 4、生物学分布研究及阻断实验 荷瘤鼠尾静脉注射0.37MBq/0.1ml99mTc-3PRGD2，2h和4h后分批处死小鼠。采集采集肿瘤、血液、肌肉、骨、心脏、肝脏、肺、肾脏、肠等重要组织和器官，称重后，用γ计数器进行放射性计数，计算％ID/g。另选SKOV-3荷瘤鼠4只，每只尾静脉同时注入0.37 MBq/0.1 ml剂量的99mTc-3PRGD2和过量未标记的E[c(RGDfK)]2，进行阻断实验。 5、免疫组织化学分析 取生物学分布研究中处死的小鼠肿瘤组织做免疫组织化学分析。将肿瘤组织常规4％多聚甲醛固定后，制备成石蜡切片，进行Ki-67、CD34和整合素αv抗体免疫组织化学染色，定量分析肿瘤增殖程度、微血管密度和整合素αvβ3表达。 6、内皮细胞管型形成实验 分别用含紫杉醇(100 mM)和夫拉平度(300 mM)的培养液培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)，37℃，5％ CO2培养24 h，然后通过内皮细胞管型形成实验检测药物在体外对HUVECs形成血管能力的影响。 7、流式细胞术分析整合素αvβ3表达 分别用含紫杉醇(100 mM)和夫拉平度(300 mM)的培养液培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)，37℃，5％ CO2培养24 h，荧光抗体染色后通过流式细胞术测定药物治疗对SKOV-3肿瘤细胞表面整合素αvβ3表达的影响。 结果： 1、肿瘤体积测定及Ki-67免疫组化结果显示紫杉醇和夫拉平度治疗都减缓了肿瘤生长，明显抑制SKOV-3细胞增殖，P＜0.05。 2、CD34免疫组化染色及内皮细胞管型形成实验分别从体内、体外证实了紫杉醇和夫拉平度都明显降低血管生成，P＜0.05。 3、紫杉醇治疗后肿瘤放射性摄取明显降低(2小时降低39.96％±8.23％，P=0.044;4小时降低35.76％±11.42％，P=0.024)，而夫拉平度治疗后肿瘤放射性摄取轻度升高(2小时升高4.42％±0.24％，P=0.898;4小时升高12.2％±1.84％,P=0.702)。 4、免疫组化染色显示紫杉醇和夫拉平度抗血管生成治疗后SKOV-3肿瘤整合素αvβ3表达具有差异性:紫杉醇治疗后整合素αvβ3表达降低34.2％±5.9％(P＜0.01)，而夫拉平度治疗后整合素αvβ3表达轻度升高8.7％±3.2％(P=0.078)。 5、流式细胞术分析表明紫杉醇治疗对于SKOV-3细胞表面整合素αvβ3表达无明显影响，而夫拉平度治疗可上调SKOV-3细胞表面整合素αvβ3表达，P＜0.05。 结论： 99mTc-3PRGD2在监测不同抗肿瘤血管生成药物治疗中具有明显差异性，因此在应用此类探针评价抗血管生成药物疗效时应特别慎重。 论文创新点： 1、成功制备了新型聚乙二醇修饰的可靶向肿瘤整合素αvβ3表达显像的探针18F-FB-NH-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2。 2、通过MicroPET显像及生物学分布研究证实了“二价”新探针18F-RGD2可用于卵巢癌显像及抗肿瘤新生血管疗效监测，并初步阐明18F-RGD2卵巢癌显像及监测抗肿瘤新生血管药物疗效的分子机制。 3、首次发现RGD多肽类探针在监测抗肿瘤血管生成治疗疗效中具有差异性，并初步阐明了其分子机制。