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随着养猪产业的快速发展,猪粪便污染问题愈发严重,这对生态环境和人类健康都造成严重威胁。而传统粪便指示菌大肠杆菌由于在自然环境中能够生存且繁殖,因此无法准确追踪宿主粪便污染源。本研究通过采集126份动物粪便样品(包含鸡,鸭,人,狗,猪,牛),应用高能量测序技术研究了粪便微生物种类及其多样性,选用微生物源示踪技术(MST),以Faecalibacterium菌为粪便污染指示菌,根据其16S rDNA序列设计引物并筛选猪粪便污染物的特异性分子标记,以定量PCR方法对猪粪便污染源进行检测与追踪。高通量测序共获取146,038条细菌16S r DNA序列。其中厚壁菌门在动物粪便中丰度较高,约占39.10%-69.44%;其次为拟杆菌门(10.64%-48.41%)、变形菌门(0.060%-39.75%)。鸡、鸭、牛、猪、人粪便微生物中平均Shannon指数分别为1.21、1.22、1.13、0.83与0.94;平均Simpson指数分别为0.65、0.63、0.60、0.46与0.55。对不同物种粪便污染物Faecalibacterium菌16S rDNA基因序列的保守区和可变区进行比对,设计一对Faecalibacterium菌通用引物(FUP)以及两对特异性引物(PFB-1和PFB-2)。PCR结果显示FUP在所有粪便DNA样品中均能扩增出目的片段,片段大小为237 bp。PFB-1和PFB-2仅在猪混合粪便样品中扩增出目的片段,片段大小分别为172 bp和225 bp,两对引物的特异性均达到100%,与其他物种粪便污染物之间无交叉反应;研究表明PFB-2阳性率(90%)略高于PFB-1(86%),且PFB-2引物的最低检测限(LOQs)(2.9拷贝数/100 ml)低于PFB-1(6.53拷贝数/100 ml)引物。由此可见PFB-2比PFB-1的灵敏度更高,更适合用来对水体中猪粪便污染进行追踪和检测。此外,使用定量PCR考察了PFB-2在不同温度和光照处理下的衰变特性,在15°C、黑暗条件下,衰变速率为0.0647h-1,持续时间为71.17 h;在25°C、光照条件下,衰变速率为k1=0.1112 h-1,持续时间为41.41 h,表明低温和暗环境下分子标记的衰变速率较慢。最后,随机采集实际环境水样,验证PFB-2作为猪粪便污染标记物的实际效果,在猪农场附近采集的三份水样中检测到的浓度分别为8.4±0.7×104、4.5±0.5×103和3.6±1.2×102拷贝数/100 ml。而在其它地点采集的水样中的检测结果为阴性。本研究实现对近期猪粪便引起的水体污染进行快速有效的检测和追踪,为水体环境中猪粪便检测提供新工具和方法,为水源安全提供保障。