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牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)和牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus 3,BPIV3)均为牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)的重要病原。牛呼吸道疾病综合征是一个严重阻碍世界养牛业健康发展的疾病,具有很高的感染率和死亡率。IBRV是双链DNA病毒,基因组为130 kb左右,可允许外源基因插入,是重组活载体疫苗的候选病毒载体,已有很多外源病毒基因成功地插入到了IBRV基因组中。牛副流感病毒3型,是引起犊牛肺炎的主要病原之一,引起的感染在世界范围内流行。牛副流感病毒3型的HN基因是病毒主要的诱导中和抗体的保护性抗原,被广泛应用于疫苗研究,如重组腺病毒载体疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗及纳米颗粒疫苗。因此,构建携带BPIV3 HN基因的重组IBRV活载体疫苗,可同时防控牛呼吸道疾病综合征中的IBRV和BPIV3的混合感染,起到一苗双防的效果。目的:牛传染性鼻气管炎可通过空气传播,其传播速度快、距离远、效率高,难以防御。随着集约化、规模化畜牧生产的发展,IBRV气溶胶在流行病传播中占据重要地位。(1)建立牛传染性鼻气管炎群体监测技术,为传染病风险评估及预报预警提供配套技术;(2)构建牛传染性鼻气管炎病毒活载体;(3)制备牛副流感病毒3型HN蛋白的多克隆抗体,为重组病毒的鉴定提供物质支撑;(4)构建携带牛副流感病毒3型HN基因的牛传染性鼻气管炎重组病毒,为IBRV和BPIV3的防控奠定基础。方法:(1)通过常规PCR,克隆IBRV g D基因,并将其连入p EASY-T3载体中,获得阳性重组质粒。对SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度等条件进行优化,建立了可用于养殖场环境中气载牛传染性鼻气管炎病原检测方法,并对规模化奶牛场进行气溶胶样本的持续监测。(2)利用p EGFP-N1和IBRV DNA为模板,获得GFP表达盒和TK(g E)基因上下游片段,经拼接获得获得含GFP表达盒且打靶基因缺失的重组转移质粒。将重组转移质粒与IBRV基因组DNA共转染MDBK细胞,经同源重组获得IBRV活载体。(3)以BPIV3的基因组为模板,采用RT-PCR方法获得HN基因,构建HN基因原核表达载体。经诱导、纯化获得融合蛋白。将纯化的重组蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,评估其诱导中和抗体的能力。(4)以IBRV DNA和BPIV3 DNA为模板,构建含HN表达盒的g E基因缺失转移载体。将转移质粒与IBRV g E-/EGFP+活载体基因组DNA共转染细胞,经同源重组获得携带HN基因的IBRV重组病毒。结果:(1)通过对SYBR Green I实时荧光定量PCR条件的优化,最佳扩增反应体系为20μL:2×SYBR Premix Ex Taq II 10μL,模板2μL,上游引物和下游引物(0.25μmol/L)各0.5μL,RNase Free dd H2O 7μL。最佳反应条件为预变性95℃30s,然后按照95℃变性5s、63℃退火延伸30s进行40个循环;溶解曲线为95℃5s、65℃60s、95℃Continuous;最后50℃30s结束反应。温度转换率为20℃/s。在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。用建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法对BVDV、BPIV-3、BCo V、BRV进行检测,这些病原核酸的检测均为阴性。该检测可检出核酸的最低模板拷贝数为101拷贝/μL,而常规PCR所能检出的核酸的最低阳性质粒拷贝数分别为102拷贝/μL。对7个规模化奶牛场进行气溶胶样本的持续监测,检测了247份样本,有2个牧场多次监测到牛传染性鼻气管炎病毒核酸阳性,与个体检测数据相符。(2)利用p EGFP-N1和IBRV DNA为模板,通过PCR获得了GFP表达盒、TK基因上下游片段、g E基因上下游片段。通过重叠PCR、酶切、回收目的片段、连接和转化等技术手段,最终获得含GFP表达盒的重组转移质粒pc DNA3.1-TKup-GFP-TKdown和pc DNA3.1-g Eup-GFP-g Edown。将重组转移质粒与IBRV基因组DNA共转染MDBK细胞,利用绿色荧光蛋白和病毒蚀斑克隆筛选,获得了IBRV活载体,PCR检测结果表明GFP基因已经插入到了重组病毒IBRV的基因组中。(3)利用BPIV3的基因组作为模板,扩增HN,构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),确定IPTG诱导最佳浓度为1mmol/L,最佳诱导温度为37℃,最佳诱导时间为6h。诱导、纯化后,经Pierce BCA Protein Assay Kit测定蛋白浓度为412μg/ml。将纯化后的BPIV3病毒蛋白HN蛋白和p ET32a(+)空载蛋白与等体积的弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂乳化,免疫新西兰兔,获得的效价高、特异性强的抗血清。(4)以IBRV DNA为模板,获得g E基因上下游片段。经重叠PCR获得片段g Eup-HN-g Edown,将其插入载体pc DNA3.1(+)中,构建了含HN表达盒的g E基因缺失转移载体pc DNA3.1-g Eup-HN-g Edown。利用脂质体转染法将该转移质粒与IBRV g E-/EGFP+突变株基因组DNA共转染MDBK,采用反向病毒蚀斑筛选法,获得了IBRV g E-/HN+突变株。PCR鉴定结果表明HN基因在重组病毒中稳定存在。利用制备的多克隆抗体作为一抗进行检测,结果表明HN基因已表达。病毒滴度测定结果表明,重组病毒的增殖能力与亲本病毒相似。结论:(1)建立并优化了奶牛场环境气溶胶群体监测技术,为传染病风险评估及预报预警提供配套技术。对规模化奶牛场进行气溶胶样本的持续监测,发现牛群中带毒牛和隐性感染牛的存在,为牛传染性鼻气管炎的早期预警及群体监测提供了关键技术。(2)构建了携带绿色荧光蛋白GFP的IBRV活载体,为IBRV活载体疫苗的研究提供物质支撑。(3)构建了BPIV3 HN基因的原核表达载体,利用p ET32a原核表达系统获得了较纯的重组蛋白,免疫新西兰兔后可诱导产生特异性抗体血清。(4)成功构建了携带HN基因的IBRV重组病毒,Western blotting证实HN基因在重组病毒感染的细胞中获得了表达。TCID50测定结果表明,重组病毒和亲本病毒之间的增殖能力差别相似。总之,本研究建立了敏感性好、特异性强的IBR气溶胶荧光定量PCR方法,为评估牛场是否存在IBR持续感染或隐性带毒牛提供技术支持,同时也为牛场提供预报预警信息;构建了携带BPIV3 HN基因的IBRV g E-/HN+,为我国牛呼吸道疾病综合征的防控提供支持。