论文部分内容阅读
目的：检测弓形虫感染诱导宿主细胞自噬的程度，研究细胞自噬在弓形虫增殖复制中的作用。方法：对使用自噬抑制剂、诱导剂作用后不同时间点的弓形虫感染复制动力学检测以及形态检测，判断自噬在弓形虫增殖复制过程中的作用。昆明小鼠（雌鼠，5-7周龄，体重16-20g）用于RH株（弓形虫强毒株）的保种和实验。将RH株腹腔注射感染小鼠平均4-5天发病无菌抽取腹水纯化弓形虫计数后感染HEF细胞用于实验。实验分组如下：①正常对照组（HEF细胞）②RH株+HEF细胞③自噬抑制剂+RH株+HEF细胞④自噬诱导剂+RH株+HEF细胞。分别用自噬抑制剂Bafilomycin A1及自噬诱导剂氯化锂作用于HEF细胞，然后将弓形虫（RH株）速殖子悬液分别以虫/细胞2:1、4:1、8:1、16:1感染HEF细胞,作用1h、2h、4h、8h、24h、48h、96h。将计数后的HEF细胞于六孔板中培养待细胞爬片贴壁后分别进行Giemsa染色和吖啶橙荧光染色，于24孔板中进行MDC（Monodansylcadaverin）荧光染色。采用吖啶橙荧光染色和MDC荧光染色检测HEF细胞自噬情况，采用Giemsa染色检测不同时间点的弓形虫感染复制动力学。通过建立弓形虫感染的小鼠模型，分别使用自噬抑制剂巴弗洛霉A1（bafilomycinA1）和自噬诱导剂氯化锂对弓形虫感染小鼠模型进行了干预，应用荧光定量PCR检测不同实验条件下弓形虫的增殖情况。结果：弓形虫增殖观察：Giemsa染色观察弓形虫速殖子在细胞内的寄生：随机镜检100个细胞，检测不同时间虫体的侵袭率和胞内平均增殖数，侵袭率=侵袭的细胞数/100×100%、胞内平均增殖数=各细胞内虫体数量总和/被侵袭的细胞数×100%。吖啶橙和MDC荧光染色用以观察判断细胞自噬过程的发生情况。吖啶橙和MDC荧光染色结果表明自噬抑制剂BafilomycinA1及自噬诱导剂氯化锂可分别抑制和促进HEF细胞自噬，Giemsa染色结果发现使用自噬诱导剂氯化锂可以促进弓形虫在HEF细胞内的增殖，使用自噬抑制剂Bafilomycin A1可以抑制弓形虫在HEF细胞内的增殖。荧光定量PCR检测实验结果表明，巴弗洛霉素A1剂量与小鼠体内弓形虫数量呈负相关，而诱导剂氯化锂与小鼠体内弓形虫数量呈正相关。结论：弓形虫感染后可促进HEF细胞自噬，促进HEF细胞自噬可以促进弓形虫在宿主细胞内的增殖，调控宿主细胞自噬可调控弓形虫增殖复制。