研究目的与意义恶性肿瘤是人类健康的首要威胁,其发病率和致死率呈现逐年上升的趋势,而肺癌是全世界最常见最致命的恶性肿瘤。由于肺部感觉神经不发达,早中期肺癌无明显症状,大部分患者确诊时已至进展期,失去手术治疗的机会。因此,临床以放、化疗为主要治疗手段,但放、化疗具有严重的毒副作用,常对人体造成不可逆的伤害,极大的降低了患者的生活质量。为此,探索新型、高效、安全的肿瘤治疗手段势在必行。美登素(DM1)是一种高效微管蛋白结合抑制剂,具有广谱抗肿瘤作用,临床常应用于各种恶性肿瘤的治疗,但由于其巨大的毒副作用、较差的水溶性以及狭窄的治疗窗极大限制了其临床应用。近年来,靶向制剂在肿瘤的临床治疗中显现出了很好的应用前景。而纳米药物输送系统能够通过EPR效应靶向至肿瘤部位,作为肿瘤等重大疾病的新治疗手段,在提高药效及降低药物毒性方面具有独特性质和优势。玉米醇溶蛋白(zein)由于其固有的良好生物相容性、无毒、体内生物降解性和自组装能力,成为该系统的合适载体。因此,本文将以玉米醇溶蛋白为运载体材料,美登素为治疗药物,通过相分离法制备包裹美登素的玉米醇溶蛋白纳米粒,进行抗非小细胞肺癌的研究,一方面实现肿瘤靶向提高抗肿瘤效果,一方面减少药物在机体正常组织中的分布降低毒副作用,并通过细胞实验及动物实验证明其有效性,为其进一步的开发利用提供相关研究依据。研究方法1、单因素考察法确定玉米醇溶蛋白纳米粒(zein nanoparticles,ZNPs)的制备工艺采用相分离法制备ZNPs,根据文献报道,对可能影响ZNPs粒径的因素:滴速、转速、反溶剂用量、玉米醇溶蛋白浓度进行单因素考察,确定制备工艺。2、Box-Behnken试验设计(BBD)优选美登素/玉米醇溶蛋白纳米粒(DM1-loaded zein nano particles,DM1-loaded ZNPs)最佳制备工艺并进行验证实验,随后对DM1-loaded ZNPs进行表征。根据单因素考察实验的结果,选择能影响ZNPs粒径大小的因素进行BBD实验,以DM1的包封率及载药量作为指标得到最佳制备工艺,并通过实验验证。随后,对DM1-loaded ZNPs的粒径、PDI、zeta电势、形态结构、体外释放特性、存放稳定性、血清稳定性等进行表征。3、DM1-loaded ZNPs的体外抗肿瘤活性实验以人源非小细胞肺癌细胞(A549)为模型,通过cell counting kit-8(cck-8)法对DM1-loaded ZNPs的体外抗肿瘤活性进行评价。4、DM1-loaded ZNPs的细胞内吞实验按照DM1-loaded ZNPs的最佳制备工艺,制备包裹荧光物质IR-780碘化物的玉米醇溶蛋白纳米粒(IR-780-loaded ZNPs),以A549细胞为模型,采用流式细胞仪及激光共聚焦显微镜对细胞的摄取情况进行观察。5、DM1-loaded ZNPs的肿瘤靶向及组织分布研究以A549细胞异种移植的荷瘤裸鼠为模型,制备IR-780-loaded ZNPs,通过尾静脉注射给予小鼠药物,于设定时间点,采用小动物活体成像仪研究DM1-loaded ZNPs的肿瘤靶向情况。实验结束后处死小鼠,收集内脏及肿瘤组织进行体外成像,并采用相关数据分析软件进行半定量分析。6、DM1-loaded ZNPs对A549肿瘤靶向治疗效果评估以荷瘤裸鼠为模型,将小鼠随机分为5个实验组,分别为:空白对照组、PBS组、空白 ZNPs 组、游离 DM1 组(0.8 mg/Kg)、DM1-loaded ZNPs 组(0.8 mg DM1 equiv./Kg)。通过尾静脉注射给予药物,单次给药后,每两天记录一次小鼠体重及肿瘤体积变化,共观察15天,15天后处死小鼠,取肿瘤组织称重并拍照,取五脏及肿瘤组织做病理组织切片。7、DM1-loaded ZNPs最大耐受剂量实验以正常雌性BALB/c小鼠为模型,通过尾静脉注射给予小鼠药物,药物剂量为DM1-loaded ZNPs 1、2、3 mg DM1 equiv./Kg,游离 DM1 1、2、3 mg/Kg,另设一组注射生理盐水作为空白对照。单次给药后,每两天记录小鼠死亡、体重变化、饮食量、粪便、毛发以及异常行为等情况,共观察15天。研究结果1、ZNPs的制备工艺通过单因素考察实现了 ZNPs的可控制备,制备所得纳米粒的粒径在100-150 nm范围内,符合EPR效应所需粒径尺寸。实验结果表明,相分离法制备ZNPs过程中滴加速率对纳米粒径基本无影响,在一定范围内,转速越低、zein浓度越高、反溶剂用量越少制备所得ZNPs的粒径越大。2、DM1-loaded ZNPs最佳制备工艺及验证实验DM1-loaded ZNPs最佳制备工艺为:取美登素母液(5 mg/mL)60 μL、zein溶液(60 mg/mL)120 μL(药载比为1:24(w/w))于2 mL离心管中,加入80 μL DMSO混匀后,在300 rpm搅拌状态下以10 s/滴速度滴加入2 mL纯净水中(溶剂反溶剂比为1:7.7(v/v)),滴加完成停止搅拌,即得。在此条件下包封率与载药量达到最大值,预计包封率为81.64%,载药量为3.24%。对该制备工艺进行验证实验,制备所得DM1-loaded ZNPs,包封率为82.97±0.80%,载药量为3.32±0.04%,表明该工艺稳定可靠。3、DM1-loaded ZNPs 的表征DM1-loaded ZNPs 粒径为 111.8±5.41 nm,PDI 为 0.214±0.03,zeta 值为 37.0±1.14 mV。利用透射电子显微镜对其形态进行观察,结果表明ZNPs具有光滑的球型表面。体外释放实验表明,DM1-loaded ZNPs的释放可分为两个阶段,即前8 h快速释放近20%DM1,随后进入缓慢释放阶段,24 h时累计释放近40%DM1。血清稳定性实验表明DM1-loaded ZNPs在24 h内可保持稳定,而存放稳定性实验表明,在4℃存储条件下DM1-loaded ZNPs在48 h内可保持稳定。4、DM1-loaded ZNPs的肿瘤细胞毒性肿瘤细胞毒性实验表明,在低剂量下DM1-loaded ZNPs的抗肿瘤效果明显优于游离DM1,但这种优势随着给药剂量的加大慢慢趋于一致。这可能是由于ZNPs能够增强肿瘤细胞的摄取内吞水平,使得同剂量下更多的DM1进入肿瘤细胞内发挥效果,但肿瘤细胞对ZNPs的摄取可能存在饱和现象,因此当剂量足够大时,游离DM1与DM1-loaded ZNPs的抗肿瘤效果趋于一致。而ZNPs无抗肿瘤作用,因此DM1-loaded ZNPs的抗肿瘤作用源于DM 1。5、DM1-loaded ZNPs的肿瘤细胞内吞水平肿瘤细胞摄取实验表明,ZNPs更容易被肿瘤细胞摄取进入细胞。通过共聚焦激光扫描显微镜观察到IR-780-loaded ZNPs处理的肿瘤细胞中具有更强的荧光信号,表明ZNPs与游离IR-780相比增加了细胞内吞摄取。流式细胞仪结果显示,肿瘤细胞对ZNPs的摄取是一个随时间增大的过程。6、DM1-loaded ZNPs的肿瘤靶向性和体内抗肿瘤效果在肿瘤靶向实验中,与游离IR-780相比,IR-780-loaded ZNPs在肿瘤部位的信号显著增加,这表明除去IR-780自身在肿瘤部位的分布,ZNPs可以有效地在肿瘤部位积聚,具有肿瘤靶向能力。生物组织分布结果显示,在肿瘤中IR-780-loaded ZNPs组的荧光强度是游离IR-780组的2.5倍。值得注意的是,相比于游离IR-780,ZNPs显著减少了在肝脏中的积聚,并增加了肺中的积聚。在体内抗肿瘤实验中,空白对照,PBS和空白ZNPs组小鼠表现出侵袭性的肿瘤生长。而游离DM1和DM1-loaded ZNPs组均能显著抑制肿瘤生长。而且,在相同条件下,DM-loaded ZNPs表现出比游离DM1更好的肿瘤抑制作用。给药后,肿瘤组织在前五天急剧减小。此后,DM1-loaded ZNPs组的肿瘤组织体积继续缓慢减小,肿瘤进展被完全抑制,而游离DM1组的肿瘤组织开始生长。实验期间,荷瘤小鼠的体重呈逐渐下降的趋势,在治疗后小鼠的体重明显优于对照组。肿瘤组织的重量结果表明,DM1-loaded ZNPs,游离DM1,ZNPs和PBS产生的肿瘤抑制率(TIR)分别为97.3%,92.7%,5.50%和 9.10%。7、DM1-loaded ZNPs的最大耐受剂量最大耐受量实验结果显示,游离DM1的最大耐受剂量为1 mg/Kg,而DM1-loaded ZNPs的最大耐受剂量是游离DM1的2倍,表明DM1-loaded ZNPs具有更好的生物耐受性,有利于进一步拓宽美登素的临床应用治疗窗口,为更高剂量更安全的给药方式提供了可能。实验期间,在最大耐受剂量范围内各给药组小鼠体重、饮食量等变化具有相同趋势,即在给药后5天内急速下降,此后缓慢上升,最终恢复至正常水平。对死亡小鼠进行解剖,发现胃肠道呈暗红色且尾部粪便似带血,结合小鼠的体重及饮食量变化推测小鼠的死亡原因可能是胃肠道出血。结论及意义本文建立了粒径可控的DM1-loaded ZNPs制备工艺,并通过BBD设计优选出了最佳的制备工艺并对其进行了验证实验及表征,DM1-loaded ZNPs具有良好的稳定性及缓慢释放特性。在细胞实验及动物实验中,证明了 DM1-loaded ZNPs具有肿瘤靶向能力,能够提高肿瘤细胞的摄取能力,相比游离DM1具有更优的抗肿瘤活性并且生物安全性更优。本文的研究结果提示DM1-loaded ZNPs可以作为高效肺癌靶向治疗药物,具有一定的临床应用前景。