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对虾养殖业是我国沿海水产养殖业的支柱产业，而病害问题是制约该产业发展的主要瓶颈之一。目前，学者们认为加强对虾基础性研究，揭示对虾自身免疫防御机制是破解上述问题的关键环节之一。近年来研究发现，存在于对虾血淋巴中的血蓝蛋白（Hemocyanin，HMC）是一种多功能的免疫分子，其除了参与携氧外，还具有酚氧化酶、抗病毒、抑菌和凝集等多种免疫学功能。有趣的是，本课题组最新研究发现，凡纳滨对虾蛋白激酶CK2α（Litopenaeusvannameicaseinkinase2α,LvCK2α）可能介导血蓝蛋白的丝氨酸磷酸化修饰，但其具体的分子调控机制与功能尚不清楚。为此，本研究在上述研究基础上对其进一步深入研究，所获主要研究结果如下：
1.LvCK2α介导的血蓝蛋白丝氨酸磷酸化修饰的分子机制研究
1.1LvCK2α与血蓝蛋白表达相关性研究
本研究在课题组前期研究发现LvCK2α可能介导血蓝蛋白丝氨酸磷酸化的基础上，从LvCK2与血蓝蛋白表达相关性入手，进一步探究了LvCK2α与血蓝蛋白之间的相互调控关系。
首先，采用RNAi与Westernblot技术分析比较血蓝蛋白干扰前后LvCK2α的表达变化情况，以及LvCK2α干扰前后血蓝蛋白的表达变化情况。结果发现，干扰血蓝蛋白或LvCK2α后，LvCK2α或血蓝蛋白的表达水平受到明显的影响，其分别呈现明显的下调和上调。
其次，采用病原刺激和Westernblot方法探究在病原刺激下LvCK2α与血蓝蛋白表达的相关性。结果显示，在副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）或海豚链球菌（Streptococcusiniae）的刺激下，LvCK2α与血蓝蛋白均呈现出先下降后上升的表达模式。
以上研究提示，LvCK2α与血蓝蛋白存在相互调控关系，且其与免疫应答密切相关。
1.2LvCK2α与血蓝蛋白相互作用研究
基于上述研究结果，进一步对LvCK2α与血蓝蛋白是否存在相互作用进行探究。
首先，在原核表达纯化GST和GST-LvCK2α以及纯化天然血蓝蛋白的基础上，采取Pull-down技术在体外水平探究LvCK2α与血蓝蛋白之间的相互作用关系。结果发现，与对照组GST相比，GST-LvCK2α在体外可与血蓝蛋白发生特异性结合。
其次，以果蝇S2细胞为模型，采用免疫共沉淀（Co-IP）方法对果蝇CK2α与血蓝蛋白的相互作用关系进行了探究。结果发现，与对照组EGFP蛋白相比，果蝇CK2α同样可与血蓝蛋白发生特异性结合。
最后，在分段克隆表达血蓝蛋白N端、M端和C端（分别命名为HMC-N、HMC-M与HMC-C）的基础之上，采用Pull-down和Co-IP方法研究CK2α与血蓝蛋白的相互作用区域。Pull-down结果显示，LvCK2α可与HMC-M和HMC-C发生特异性结合，但不能与HMC-N相结合；Co-IP结果进一步证实，果蝇CK2α同样可与HMC-C发生特异性相互作用。
上述结果证实，LvCK2α可与血蓝蛋白发生特异性结合，其结合区域为血蓝蛋白的C端。
1.3LvCK2α介导的血蓝蛋白丝氨酸磷酸化位点的鉴定
在上述研究基础上，本研究进一步对LvCK2α介导的血蓝蛋白丝氨酸磷酸化修饰的位点进行了预测。
首先，采用生物信息学方法对血蓝蛋白C端中CK2介导的潜在磷酸化位点进行预测。结果发现，血蓝蛋白C端存在3个潜在丝氨酸磷酸化位点：Ser426、Ser446和Ser548，其中，Ser548位点在不同物种血蓝蛋白中最为保守。
继而，在果蝇S2细胞中采用定点突变及Co-IP方法，选择Ser548位点进行进一步鉴定。结果发现，Ser548位点突变后，果蝇CK2α不能与HMC-C相互作用。
上述结果表明，LvCK2α可能通过结合血蓝蛋白C端介导Ser548的磷酸化修饰，至于其确实情况，还有待于通过位点抗体制备、Co-IP与Westernblot等1.2LvCK2α与血蓝蛋白相互作用研究
基于上述研究结果，进一步对LvCK2α与血蓝蛋白是否存在相互作用进行探究。
首先，在原核表达纯化GST和GST-LvCK2α以及纯化天然血蓝蛋白的基础上，采取Pull-down技术在体外水平探究LvCK2α与血蓝蛋白之间的相互作用关系。结果发现，与对照组GST相比，GST-LvCK2α在体外可与血蓝蛋白发生特异性结合。
其次，以果蝇S2细胞为模型，采用免疫共沉淀（Co-IP）方法对果蝇CK2α与血蓝蛋白的相互作用关系进行了探究。结果发现，与对照组EGFP蛋白相比，果蝇CK2α同样可与血蓝蛋白发生特异性结合。
最后，在分段克隆表达血蓝蛋白N端、M端和C端（分别命名为HMC-N、HMC-M与HMC-C）的基础之上，采用Pull-down和Co-IP方法研究CK2α与血蓝蛋白的相互作用区域。Pull-down结果显示，LvCK2α可与HMC-M和HMC-C发生特异性结合，但不能与HMC-N相结合；Co-IP结果进一步证实，果蝇CK2α同样可与HMC-C发生特异性相互作用。
上述结果证实，LvCK2α可与血蓝蛋白发生特异性结合，其结合区域为血蓝蛋白的C端。
1.3LvCK2α介导的血蓝蛋白丝氨酸磷酸化位点的鉴定
在上述研究基础上，本研究进一步对LvCK2α介导的血蓝蛋白丝氨酸磷酸化修饰的位点进行了预测。
首先，采用生物信息学方法对血蓝蛋白C端中CK2介导的潜在磷酸化位点进行预测。结果发现，血蓝蛋白C端存在3个潜在丝氨酸磷酸化位点：Ser426、Ser446和Ser548，其中，Ser548位点在不同物种血蓝蛋白中最为保守。
继而，在果蝇S2细胞中采用定点突变及Co-IP方法，选择Ser548位点进行进一步鉴定。结果发现，Ser548位点突变后，果蝇CK2α不能与HMC-C相互作用。
上述结果表明，LvCK2α可能通过结合血蓝蛋白C端介导Ser548的磷酸化修饰，至于其确实情况，还有待于通过位点抗体制备、Co-IP与Westernblot等实验进一步研究和证实。
2.LvCK2α介导的血蓝蛋白丝氨酸磷酸化修饰对其生物学功能的影响研究
为了进一步探究LvCK2α介导的血蓝蛋白丝氨酸磷酸化修饰对其生物学功能的影响，从血蓝蛋白携氧活性、降解片段产生能力及免疫学活性方面展开了如下研究：
2.1干扰LvCK2α对血蓝蛋白携氧活性影响的研究
首先，采用荧光光谱扫描法测定血蓝蛋白最适激发波长和最适发射波长。结果显示，血蓝蛋白的最适激发波长为285nm，最适发射波长为330nm。
其次，采用RNAi、分子筛层析、过氧化氢酶增氧、葡萄糖氧化酶去氧以及荧光光谱扫描等方法，分析比较LvCK2α干扰前后的血蓝蛋白携氧活性的变化情况。结果发现，与对照组相比，LvCK2α干扰后的血蓝蛋白携氧活性显著下降。
2.2干扰LvCK2α对血蓝蛋白降解片段产生能力的影响研究
首先，采取病原刺激和Westernblot等方法探究病原刺激下血蓝蛋白丝氨酸磷酸化修饰与其降解片段产生的相关性。结果发现，副溶血弧菌与海豚链球菌刺激下，血蓝蛋白丝氨酸磷酸化水平呈现先下降后上升的趋势，而血蓝蛋白降解片段产生的数量呈现先增多后减少的趋势，且血蓝蛋白丝氨酸磷酸化水平最低时，降解片段产生的数量最多。
其次，采用RNAi、分子筛层析、Trypsin酶解和ELISA等方法，分析LvCK2α干扰前后的血蓝蛋白与Trypsin结合能力及其降解片段产生能力的变化情况。结果发现，与对照组相比，LvCK2α干扰后的血蓝蛋白与Trypsin结合力更强，且其经Trypsin酶解后产生的降解片段更多。
以上提示，LvCK2α介导的丝氨酸磷酸化可抑制血蓝蛋白降解片段的产生。
2.3干扰LvCK2α对血蓝蛋白及其降解片段的免疫学活性影响研究
首先，采用RNAi、分子筛层析、Trypsin酶解和抑菌实验等方法，分析LvCK2α干扰前后的血蓝蛋白及其Trypsin酶解产物的抑菌活性变化情况。结果发现，与对照组相比，LvCK2α干扰后的血蓝蛋白对副溶血弧菌和海豚链球菌的抑菌活性均显著上升，且其经Trypsin酶解后抑菌活性进一步增强。
其次，运用RNAi、分子筛层析、Trypsin酶解和酚氧化酶活性检测等方法，分析LvCK2α干扰前后的血蓝蛋白及其Trypsin酶解产物的酚氧化物酶活性变化情况。结果发现，与对照组相比，LvCK2α干扰后的血蓝蛋白酚氧化酶活性显著上升，且其经Trypsin酶解后酚氧化酶活性进一步升高。
以上结果表明，降低LvCK2α介导的丝氨酸磷酸化修饰可增强血蓝蛋白及其降解片段的抑菌和酚氧化酶活性。
综上所述，本研究领先发现LvCK2α可能通过结合血蓝蛋白C端而介导Ser548等位点的磷酸化修饰，且其修饰化程度的高低与血蓝蛋白携氧活性、降解片段产生以及免疫学活性的发挥密切相关。所获研究结果为深入揭示血蓝蛋白磷酸化修饰形成的分子机制及其生物学功能相关性奠定了良好的基础，同时，为寻找新的对虾病害防控策略提供了新的思路与科学依据，促进对虾养殖业的健康、可持续发展。
1.LvCK2α介导的血蓝蛋白丝氨酸磷酸化修饰的分子机制研究
1.1LvCK2α与血蓝蛋白表达相关性研究
本研究在课题组前期研究发现LvCK2α可能介导血蓝蛋白丝氨酸磷酸化的基础上，从LvCK2与血蓝蛋白表达相关性入手，进一步探究了LvCK2α与血蓝蛋白之间的相互调控关系。
首先，采用RNAi与Westernblot技术分析比较血蓝蛋白干扰前后LvCK2α的表达变化情况，以及LvCK2α干扰前后血蓝蛋白的表达变化情况。结果发现，干扰血蓝蛋白或LvCK2α后，LvCK2α或血蓝蛋白的表达水平受到明显的影响，其分别呈现明显的下调和上调。
其次，采用病原刺激和Westernblot方法探究在病原刺激下LvCK2α与血蓝蛋白表达的相关性。结果显示，在副溶血弧菌（Vibrioparahaemolyticus）或海豚链球菌（Streptococcusiniae）的刺激下，LvCK2α与血蓝蛋白均呈现出先下降后上升的表达模式。
以上研究提示，LvCK2α与血蓝蛋白存在相互调控关系，且其与免疫应答密切相关。
1.2LvCK2α与血蓝蛋白相互作用研究
基于上述研究结果，进一步对LvCK2α与血蓝蛋白是否存在相互作用进行探究。
首先，在原核表达纯化GST和GST-LvCK2α以及纯化天然血蓝蛋白的基础上，采取Pull-down技术在体外水平探究LvCK2α与血蓝蛋白之间的相互作用关系。结果发现，与对照组GST相比，GST-LvCK2α在体外可与血蓝蛋白发生特异性结合。
其次，以果蝇S2细胞为模型，采用免疫共沉淀（Co-IP）方法对果蝇CK2α与血蓝蛋白的相互作用关系进行了探究。结果发现，与对照组EGFP蛋白相比，果蝇CK2α同样可与血蓝蛋白发生特异性结合。
最后，在分段克隆表达血蓝蛋白N端、M端和C端（分别命名为HMC-N、HMC-M与HMC-C）的基础之上，采用Pull-down和Co-IP方法研究CK2α与血蓝蛋白的相互作用区域。Pull-down结果显示，LvCK2α可与HMC-M和HMC-C发生特异性结合，但不能与HMC-N相结合；Co-IP结果进一步证实，果蝇CK2α同样可与HMC-C发生特异性相互作用。
上述结果证实，LvCK2α可与血蓝蛋白发生特异性结合，其结合区域为血蓝蛋白的C端。
1.3LvCK2α介导的血蓝蛋白丝氨酸磷酸化位点的鉴定
在上述研究基础上，本研究进一步对LvCK2α介导的血蓝蛋白丝氨酸磷酸化修饰的位点进行了预测。
首先，采用生物信息学方法对血蓝蛋白C端中CK2介导的潜在磷酸化位点进行预测。结果发现，血蓝蛋白C端存在3个潜在丝氨酸磷酸化位点：Ser426、Ser446和Ser548，其中，Ser548位点在不同物种血蓝蛋白中最为保守。
继而，在果蝇S2细胞中采用定点突变及Co-IP方法，选择Ser548位点进行进一步鉴定。结果发现，Ser548位点突变后，果蝇CK2α不能与HMC-C相互作用。
上述结果表明，LvCK2α可能通过结合血蓝蛋白C端介导Ser548的磷酸化修饰，至于其确实情况，还有待于通过位点抗体制备、Co-IP与Westernblot等1.2LvCK2α与血蓝蛋白相互作用研究
基于上述研究结果，进一步对LvCK2α与血蓝蛋白是否存在相互作用进行探究。
首先，在原核表达纯化GST和GST-LvCK2α以及纯化天然血蓝蛋白的基础上，采取Pull-down技术在体外水平探究LvCK2α与血蓝蛋白之间的相互作用关系。结果发现，与对照组GST相比，GST-LvCK2α在体外可与血蓝蛋白发生特异性结合。
其次，以果蝇S2细胞为模型，采用免疫共沉淀（Co-IP）方法对果蝇CK2α与血蓝蛋白的相互作用关系进行了探究。结果发现，与对照组EGFP蛋白相比，果蝇CK2α同样可与血蓝蛋白发生特异性结合。
最后，在分段克隆表达血蓝蛋白N端、M端和C端（分别命名为HMC-N、HMC-M与HMC-C）的基础之上，采用Pull-down和Co-IP方法研究CK2α与血蓝蛋白的相互作用区域。Pull-down结果显示，LvCK2α可与HMC-M和HMC-C发生特异性结合，但不能与HMC-N相结合；Co-IP结果进一步证实，果蝇CK2α同样可与HMC-C发生特异性相互作用。
上述结果证实，LvCK2α可与血蓝蛋白发生特异性结合，其结合区域为血蓝蛋白的C端。
1.3LvCK2α介导的血蓝蛋白丝氨酸磷酸化位点的鉴定
在上述研究基础上，本研究进一步对LvCK2α介导的血蓝蛋白丝氨酸磷酸化修饰的位点进行了预测。
首先，采用生物信息学方法对血蓝蛋白C端中CK2介导的潜在磷酸化位点进行预测。结果发现，血蓝蛋白C端存在3个潜在丝氨酸磷酸化位点：Ser426、Ser446和Ser548，其中，Ser548位点在不同物种血蓝蛋白中最为保守。
继而，在果蝇S2细胞中采用定点突变及Co-IP方法，选择Ser548位点进行进一步鉴定。结果发现，Ser548位点突变后，果蝇CK2α不能与HMC-C相互作用。
上述结果表明，LvCK2α可能通过结合血蓝蛋白C端介导Ser548的磷酸化修饰，至于其确实情况，还有待于通过位点抗体制备、Co-IP与Westernblot等实验进一步研究和证实。
2.LvCK2α介导的血蓝蛋白丝氨酸磷酸化修饰对其生物学功能的影响研究
为了进一步探究LvCK2α介导的血蓝蛋白丝氨酸磷酸化修饰对其生物学功能的影响，从血蓝蛋白携氧活性、降解片段产生能力及免疫学活性方面展开了如下研究：
2.1干扰LvCK2α对血蓝蛋白携氧活性影响的研究
首先，采用荧光光谱扫描法测定血蓝蛋白最适激发波长和最适发射波长。结果显示，血蓝蛋白的最适激发波长为285nm，最适发射波长为330nm。
其次，采用RNAi、分子筛层析、过氧化氢酶增氧、葡萄糖氧化酶去氧以及荧光光谱扫描等方法，分析比较LvCK2α干扰前后的血蓝蛋白携氧活性的变化情况。结果发现，与对照组相比，LvCK2α干扰后的血蓝蛋白携氧活性显著下降。
2.2干扰LvCK2α对血蓝蛋白降解片段产生能力的影响研究
首先，采取病原刺激和Westernblot等方法探究病原刺激下血蓝蛋白丝氨酸磷酸化修饰与其降解片段产生的相关性。结果发现，副溶血弧菌与海豚链球菌刺激下，血蓝蛋白丝氨酸磷酸化水平呈现先下降后上升的趋势，而血蓝蛋白降解片段产生的数量呈现先增多后减少的趋势，且血蓝蛋白丝氨酸磷酸化水平最低时，降解片段产生的数量最多。
其次，采用RNAi、分子筛层析、Trypsin酶解和ELISA等方法，分析LvCK2α干扰前后的血蓝蛋白与Trypsin结合能力及其降解片段产生能力的变化情况。结果发现，与对照组相比，LvCK2α干扰后的血蓝蛋白与Trypsin结合力更强，且其经Trypsin酶解后产生的降解片段更多。
以上提示，LvCK2α介导的丝氨酸磷酸化可抑制血蓝蛋白降解片段的产生。
2.3干扰LvCK2α对血蓝蛋白及其降解片段的免疫学活性影响研究
首先，采用RNAi、分子筛层析、Trypsin酶解和抑菌实验等方法，分析LvCK2α干扰前后的血蓝蛋白及其Trypsin酶解产物的抑菌活性变化情况。结果发现，与对照组相比，LvCK2α干扰后的血蓝蛋白对副溶血弧菌和海豚链球菌的抑菌活性均显著上升，且其经Trypsin酶解后抑菌活性进一步增强。
其次，运用RNAi、分子筛层析、Trypsin酶解和酚氧化酶活性检测等方法，分析LvCK2α干扰前后的血蓝蛋白及其Trypsin酶解产物的酚氧化物酶活性变化情况。结果发现，与对照组相比，LvCK2α干扰后的血蓝蛋白酚氧化酶活性显著上升，且其经Trypsin酶解后酚氧化酶活性进一步升高。
以上结果表明，降低LvCK2α介导的丝氨酸磷酸化修饰可增强血蓝蛋白及其降解片段的抑菌和酚氧化酶活性。
综上所述，本研究领先发现LvCK2α可能通过结合血蓝蛋白C端而介导Ser548等位点的磷酸化修饰，且其修饰化程度的高低与血蓝蛋白携氧活性、降解片段产生以及免疫学活性的发挥密切相关。所获研究结果为深入揭示血蓝蛋白磷酸化修饰形成的分子机制及其生物学功能相关性奠定了良好的基础，同时，为寻找新的对虾病害防控策略提供了新的思路与科学依据，促进对虾养殖业的健康、可持续发展。