亚洲玉米螟在织金县发生规律调查及其Hsp21.8和Hsp24.3的克隆与表达研究

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玉米是贵州省重要的粮食作物,亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis是对玉米产量造成影响的主要害虫,严重影响玉米质量和产量。本研究通过连续两年对贵州省亚洲玉米螟田间消长动态和迁移扩散规律调查研究,明确了亚洲玉米螟田间发生规律,为有效制定预防方案与科学采取预防措施予以合理的参考根据;热激蛋白是生物在适应外界不良环境中产生的一种抗逆蛋白,在昆虫响应外界胁迫的阶段中发挥着关键作用,利用RT-PCR技术克隆了亚洲玉米螟两种小分子热激蛋白基因Hsp21.8和Hsp24.3,基于生物信息学分析了它们的序列特征和同源性;利用实时荧光PCR技术检测了它们在亚洲玉米螟各个发育过程与不同组织中的表达谱;研究了Hsp21.8和Hsp24.3在不同胁迫因子下的差异表达,为揭示亚洲玉米螟对环境胁迫出现响应的分子机理奠定基础。本文主要研究结论如下:1、亚洲玉米螟在织金县的发生规律调查(1)亚洲玉米螟在织金县的田间发生规律在织金县玉米主要鳞翅目害虫有亚洲玉米螟、黏虫、桃蛀螟三种。亚洲玉米螟幼虫在春、夏玉米田整个生育期都存在,在春玉米的抽雄期和乳熟期发生量最多,在夏玉米上以蜡熟期发生量最多。在春播和复播的玉米各个时期,亚洲玉米螟发现率都远高于其他几种鳞翅目害虫。2017-2018年调查发现每年均出现了3个成蛾诱集高峰期,且这三个高峰期分别出现在6月上中旬、8月上中旬、9月上旬。在卵和幼虫方面出现了3个落卵高峰期,3个幼虫高峰期,这初步表明该地区玉米螟可能一年发生不完全3代。亚洲玉米螟越冬代成虫5月中下旬在一般年份的玉米田中逐渐发生,6月上旬逐渐产出一代卵,下旬在田间发生亚洲玉米螟危害。7月中旬田间出现初代成虫,7月下旬田间出现第二代卵,第二代幼虫的危害出现在8月上旬,直到采摘果穗。(2)亚洲玉米螟田间迁移扩散规律在亚洲玉米螟成蛾的迁移扩散方面,同一时期不同距离诱集到的成蛾数量并没有显著呈现出随距离增加数量显著降低的趋势,这说明亚洲玉米螟成蛾的飞翔能力相对较强,其活动范围并没有局限于羽化地点附近。亚洲玉米螟发生危害的田间系统调查则表明,距村庄越近的春播玉米田,其亚洲玉米螟卵、幼虫的数量也越大,为害相比也越为严重,村庄为春播玉米的主要虫源地;复播玉米种植后,春播玉米田又成为其主要虫源地,并迅速向周边复播玉米田迁移扩散。建议在生产实际中:春、复播玉米应优先防治距虫源地1.0 km范围。本研究过程中并未在不同距离的复播玉米田发现第二代亚洲玉米螟蛹,说明该地区还是以一年发生两代亚洲玉米螟为主。2、亚洲玉米螟Hsp21.8和Hsp24.3的克隆与表达谱分析本研究采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术克隆亚洲玉米螟热激蛋白基因Hsp21.8、Hsp24.3,并利用生物信息学方法分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)技术检测了亚洲玉米螟Hsp21.8、Hsp24.3在不同龄期和成虫中的表达模式。结果发现Hsp21.8开放阅读框长588 bp,编码195个氨基酸;编码蛋白相对分子量为21.83 k D;等电点(pl)为6.25;带负电荷的残基总数(Asp+Glu)为31个,带正电荷的残基总数(Aro+Lys)为28个;分子式为C977H1563N269O293S2;具有细胞质型热激蛋白氨基酸特征,属于胞质热激蛋白。Hsp24.3基因开放阅读框长663bp,编码220个氨基酸,编码蛋白相对分子量为24.33 k D;等电点(pl)为4.6;带负电荷的残基总数(Asp+Glu)为37个,带正电荷的残基总数(Aro+Lys)为22个;分子式为C1095H1691N281O344S2;具有细胞质型热激蛋白氨基酸特征,属于胞质热激蛋白。Hsp21.8和Hsp24.3在玉米螟整个发育阶段均有表达,其中Hsp21.8在蛹期的相对表达量最高,是雌成虫相对表达量的4.02倍,是雄虫相对表达量的26.13倍,卵期~5龄期相对表达量轻微浮动;Hsp24.3雄虫相对表达量最高,是雌虫的相对表达量的8.98倍,卵期~蛹期相对表达量轻微浮动。总体来说Hsp24.3、Hsp21.8在亚洲玉米螟蛹期之前相对表达量较为稳定。3、亚洲玉米螟Hsp21.8和Hsp24.3响应环境胁迫的表达研究检测了亚洲玉米螟Hsp21.8和Hsp24.3在UV-A、高、低温胁迫下的差异表达。结果表明:在UV-A胁迫下,亚洲玉米螟雄、雌成虫Hsp21.8的相对表达量分别于60 min和30 min达到峰值;Hsp24.3分别于150min和120min达到峰值;在4℃胁迫下,亚洲玉米螟雄、雌成虫Hsp24.3相对表达量均于120min达到峰值;Hsp21.8均在150min达到峰值;在36℃胁迫下,玉米螟雄、雌成虫Hsp21.8相对表达量均在60min达到峰值,Hsp21.8基因均于90min达到峰值。
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