微小血管或称为毛细血管，遍布全身，供给组织营养，同时带走“废物”。通常，微小血管的大小及数目不会增加，但在一些情况下，如月经期、组织损伤修复等会发生毛细血管再生，称为血管生成。肿瘤生长依赖血管生成。如果没有血管生成，实体肿瘤生长到0.2-0.3mm时，肿瘤细胞将因缺乏营养而停止生长和死亡。血管生成抑制剂能显著抑制肿瘤的生长。体内至少有14种促血管生成因子，VEGF是肿瘤细胞分泌的具有多种功能的细胞因子，被认为是其中最重要的调节因子。VEGF选择性作用于血管内皮细胞上的两种Ⅲ型酪氨酸激酶受体—KDR／Flk-1和Flt-1，使后者自身的酪氨酸残基磷酸化，激活磷脂酶C及GTP酶活化蛋白(GAP)，生物作用为增加血管通透性，使血管内皮细胞迁移、增殖，促进新生血管形成。常见的的恶性实体肿瘤均有VEGF的过量表达。已有研究表明，抑制VEGF的活性能显著抑制肿瘤的生长。1993年，Kim首次报道抗VEGF单克隆抗体抑制荷瘤鼠的肿瘤生长，随后又发现其抑制转移瘤的发生。本研究根据抗原指数等抗原表位预测方法，设计VEGF氨基端1—50残基内一段多肽为合成序列，在ABI 431固相自动肽合成仪上合成。利用合成肽及杂交瘤技术制备抗人VEGF单克隆抗体(NAb)杂交瘤细胞株E11。并对其分泌的MAb之反应性、特异性及体外阻断内皮细胞增殖的活性进行了鉴定。继用该MAb结合免疫组化方法，对20例颊癌组织标本中VEGF的表达及分布进行了研究。结果表明：合成肽单抗可与VEGF原蛋白特异结合，有体外阻断内皮细胞增殖的活力。免疫组化显示：20例标本中阳性率为80％，其中12例(高、中分化)呈阳性，4例(低分化)呈强阳性。VEGF主要分布在肿瘤细胞胞浆及邻近肿瘤组织的小血管内皮细胞中。肿瘤周围正常组织未见VEGF表达。说明VEGF表达与颊癌的血管生成具有显著的相关性。体内抑瘤实验证实，该MAb能显著抑制荷瘤鼠实体瘤的生长(资料见另文)由于鼠源单抗在人体内易诱发人抗鼠抗体(HAMA)免疫反应，其临床应用严重受限。基因工程技术对抗体的改造(即抗体基因重组及人源化)可降低其免疫源性，抗体工程也因此成为国内外研究热点。单链抗体(scFv)以其分子量小，穿透力强，免疫源性低，易于大量生产等优点，得到了较为广泛的应用。为有效的提供临床应用，本研究从杂交瘤细胞株E11中，通过逆转录及多聚酶连式反应，扩增并克隆了E11的可变区基因片断。用一编码亲水性多肽接头的DNA片断将E11单抗轻、重链可变区基因连接，构建表达载体PET—15YV，并导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。表达产物经变性及复性处理后，用免疫组化方法检测其活性。经测序表明，VL基因全长333bp，编码111个氨基酸，归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。VH基因全长369bp，编码123个氨基酸，归属小鼠重链可变区基因Ⅱ(A)亚组。表达产物主要以包涵体形式存在，表达量约40％，用免疫组化方法对颊癌组织进行检测的结果表明，基因工程抗体scFv与原代抗体一样，具有相同的抗原结合活性及较高的组织特异性。本实验结果提示：抗人VEGF单链抗体具有潜在的临床应用前景，可作为生物导向药物，为肿瘤放射免疫显象及以血管为靶目标的抗血管生成治疗奠定了良好基础。最后，本研究又利用Biosym公司开发的计算机辅助分子设计系统模建了抗人VEGF scFv的三维结构，并对其重要的残基进行了分析。结构的合理性验证显示模建结构是合理的。本研究为深入理解抗原抗体相互识别机制，为抗体的人源化改造打下了基础。