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研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年发病的以进行性认知功能障碍和记忆力减退为主要临床表现的神经变性疾病。Tau蛋白过度磷酸化形成的神经元纤维缠结和Ap异常沉积形成的老年斑是AD典型的病理损害,另外,自由基损伤和氧化应激,内质网应激在AD的病理过程中也发挥重要作用。AD的发病机制迄今尚不清楚,亦缺少有效的治疗方法,故研究其发病机制及针对发病机制研究新型抗AD药物是十分必要的。晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)是蛋白质和脂质经非酶促糖基化反应生成的不可逆的终末产物。随着年龄增长,体内AGEs生成增加,特别是胰岛素抵抗及糖尿病患者体内AGEs增加更为明显。AGEs能介导多种病理过程,近年来研究显示,AGEs可能是引起AD等认知功能障碍疾病的原因之一。AGEs在AD神经元纤维缠结和老年斑大量聚集,且随着病情进展脑内AGEs聚集增多,贯穿整个AD病程。AGEs一方面通过直接的毒性作用促进蛋白质或脂质交联,对神经原纤维缠结和老年斑进行修饰,并诱发AD早期的炎症反应。另一方面,AGEs还可与其受体(recepter for advanced glycation end products, RAGE)结合,激活一系列信号转导通路,参与AD的病理过程。Li等的研究表明AGEs与RAGE结合诱导磷酸化tau蛋白表达增加,提示AGEs-RAGE通路与神经元纤维缠结的形成密切相关。体外实验显示,AGEs与RAGE的结合能够启动氧化应激和内质网应激导致细胞的损伤。由此可见,AGEs-RAGE通路通过多种途径促进AD发生发展,在AD发病过程中有至关重要的作用。但是,AGEs如何通过其受体RAGE影响tau蛋白磷酸化以及导致内质网应激迄今为止尚不清楚。基于RAGE在AD中的重要作用,降低RAGE的表达或者竞争性阻断RAGE与配体的结合可望成为AD治疗的新靶点。目前阻断RAGE的措施主要有RAGE抗体及sRAGE,但是均不能通过血脑屏障,不能阻断脑内RAGE与配体的结合,对AD的疗效受到限制。RAGE阻断剂TTP488(岜称为PF-04494700)因其高剂量治疗产生的副作用导致临床实验终止。因此,研究新的安全有效的阻断RAGE的药物具有非常重要的意义。Deane于2012年首次报道了一种新型小分子RAGE阻断剂FPS-ZM1,低毒性、高亲和力,且有良好的血脑屏障通透性,腹腔给药通过抑制脑内Ap生成和炎症反应可明显改善AD模型小鼠的学习记忆能力,是一种有临床应用前景的RAGE阻断剂。我们前期研究发现FPS-ZM1可以阻断AGEs-RAGE诱导的脑内Ap生成和炎症反应,改善大鼠的认知功能。但FPS-ZM1的神经保护作用机制需要进一步研究,尤其该药物是否对AGEs诱导的脑内tau蛋白磷酸化、氧化应激和内质网应激产生影响尚未见报道。研究目的建立AGEs损伤动物模型,研究AGEs-RAGE对认知功能、tau蛋白磷酸化、氧化应激和内质网应激相关指标的影响；进一步探讨FPS-ZM1对AGEs诱导脑损伤的保护作用及其机制。研究方法1.AGEs损伤大鼠模型的建立及分组6-8周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠,随机分为4组,正常对照组(Control), FPS-ZM1对照组(FZM1), AGEs模型组(AGEs), AGEs+FPS-ZM1干预组(AGEs+FZM1),每组10只。脑立体定位注射的方法造模,AGEs和AGEs+FZM1组双侧海马注射AGE-BSA 5μl, Control和FZM1组注射同等量的生理盐水。造模前1周开始,FZM1和AGEs+FZM1组每天腹腔注射FPS-ZM1(1mg/kg/d,2ml)共4周,Control和AGEs组每天腹腔注射2m1生理盐水共4周。2.行为学检测：Morris水迷宫实验用于评估各组大鼠的学习和记忆能力。3. Western blot和免疫组化检测海马RAGE蛋白的表达。4. Western blot检测海马tau蛋白磷酸化水平,Tau-5(总tau),PHF-1 (Phospho-tau at Ser396/404), PT231 (Phospho-tau at Thr231).5. Western blot检测海马Akt和GSK-3β磷酸化水平,t-Akt(total Akt),Ser473-Akt (Phospho-Akt at Ser 473), tGSK-3β (total GSK-3β), S9-GSK3p (Phospho-GSK-3β atSer9)。6.组织活性氧荧光定量(DCFH-DA)法检测各组大鼠海马区活性氧(ROS)水平；丙二醛(MDA)法检测海马脂质过氧化(lipid peroxidation, LPO)水平；生化方法检测各组大鼠海马超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性或含量。7. Western blot检测内质网应激相关指标GRP78, p-PERK, p-eIF2a,CHOP, caspase-12。8.分光光度法测定细胞凋亡相关蛋白酶caspase-3, caspase-9的活性。研究结果1. Morris水迷宫成绩比较Morris水迷宫实验第3天开始,AGEs组大鼠逃避潜伏期较Control组明显延长(P<0.05),与AGEs组对比,AGEs+FZM1组逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)。AGEs组大鼠穿越平台所在位置的次数和在目标象限的时间较Control组显著减少(P<0.01, P<0.01), AGEs+FZM1组大鼠穿越平台的次数和在目标象限的时间较AGEs组明显增加(P<0.01,P<0.01)。四组动物的游泳速度无显著差异。2.各组大鼠海马组织RAGE蛋白表达比较Western blot显示,AGEs组大鼠脑组织RAGE蛋白表达明显高于Control组(P<0.01), AGEs+FZM1组大鼠脑组织RAGE蛋白表达较AGEs组降低,差异有统计学意义(P<0.01)。Control组和FZM1组之间无明显差异(P>0.05)。免疫组化显示,Control组和FZM1组RAGE少量表达,AGEs组RAGE蛋白表达明显高于Control组,着色呈棕黄色,阳性细胞数多,差异有统计学意义(P<0.05), AGEs+FZM1组大鼠脑组织RAGE表达较AGEs组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3.各组大鼠海马组织磷酸化tau蛋白,Akt,GSK3β表达的比较AGEs组大鼠脑组织PHF-1,PT231蛋白表达相对系数分别为0.87和0.79,是Control组蛋白表达相对系数(0.39,0.27)的2.2倍和2.9倍,差异有统计学意义(P<0.01, P<0.01), AGEs+FZM1组大鼠PHF-1,PT231蛋白表达相对系数(0.38,0.41)较AGEs组降低,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。AGEs组大鼠脑组织Ser473-Akt和S9-GSK3p蛋白表达相对系数为0.36和0.40,较Control组.(0.72,0.76)明显降低,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01),给予FPS-ZM1干预后,AGEs+FZM 1组脑组织Ser473-Akt和S9-GSK3p蛋白表达相对系数为0.55和0.61,与AGEs组比较差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01),各组大鼠脑组织t-Akt和tGSK-3β蛋白表达无差异(P>0.05)。4.各组大鼠海马组织氧化应激及抗氧化能力的比较本实验以ROS、LPO水平评价海马氧化损伤的程度。AGEs组大鼠脑组织ROS和LPO水平较Control组明显升高(P<0.01,P<0.01),AGEs+FZM1组大鼠脑组织ROS和LPO水平较AGEs组降低(P<0.01,P<0.05), AGEs+FZM1组大鼠脑组织ROS和LPO水平仍高于Control组,Control组和FZM1组之间无明显差异(P>0.05)。SOD、GPx活性以及GSH含量可间接反映体内清除自由基的能力。AGEs组大鼠脑组织SOD和GPx活性较Control组明显降低(P<0.01,P<0.01),AGEs+FZM1组大鼠脑组织SOD和GPx活性较AGEs组升高(P<0.01,P<0.01),AGEs+FZM1组大鼠脑组织SOD和GPx活性仍低于Control组,Control组和FZM1组之间无明显差异(P>0.05)。AGEs组大鼠脑组织GSH含量较Control组明显降低(P<0.01),AGEs+FZM1组大鼠脑组织GSH含量较AGEs组升高(P<0.05),Control组和FZM1组之间无明显差异(P>0.05)。5.各组大鼠海马内质网应激及凋亡相关因子的比较AGEs组大鼠脑组织GRP78,p-PERK, p-eIF2a蛋白表达相对系数为(0.66,0.69,0.71),是Control组1.9,2.1和1.8倍,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01,P<0.01), AGEs+FZM1组脑组织GRP78,p-PERK,p-eIF2a蛋白表达相对系数为(0.44,0.35,0.52),较AGEs组降低,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01,P<0.05),AGEs+FZM1组蛋白表达仍高于Control组,Control组和FZM1组之间无明显差异(P>0.05)。AGEs组大鼠脑组织CHOP和caspase-12蛋白表达相对系数为0.80和0.74,是Control组(0.38,0.34)的2.1和2.2倍,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01),AGEs+FZM1组脑组织CHOP和caspase-12蛋白表达相对系数为0.59和0.42,较AGEs组降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。Control组和FZM1组之间无明显差异(P>0.05)。AGEs组大鼠脑组织caspase-3和caspase-9活性分别是Control组的2.6和1.7倍,差异有统计学意义(P<0.01, P<0.01), AGEs+FZM1组脑组织caspase-3和caspase-9活性较AGEs组降分别降低46%和29%,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。Control组和FZM1组之间无明显差异(P>0.05)。研究结论1. AGEs海马注射导致大鼠学习记忆能力下降,FPS-ZM1通过阻断RAGE,能够减轻AGEs诱导的神经损伤,改善认知功能。2. AGEs-RAGE导致tau蛋白在多个AD相关位点的异常过度磷酸化,Akt/GSK-3β通路可能参与其中,FPS-ZM1能够阻断RAGE,降低GSK-3β的活性和tau蛋白异常磷酸化的水平。3. AGEs与RAGE结合激活氧化应激参与脑损害,FPS-ZM1增强脑组织的抗氧化能力,阻断AGEs-RAGE介导的氧化应激,是其发挥脑保护作用的内在机制之一。4. AGEs与RAGE结合能够引发内质网应激,分子伴侣GRP78及信号通路相关蛋白p-PERK和p-eIF2α表达增高,凋亡相关因子CHOP和caspase-12活化。FPS-ZM1具有脑保护作用,通过阻断RAGE,下调GRP78、p-PERK、 p-eIF2α和凋亡相关因子的表达,有效阻断内质网应激反应。研究意义RAGE通过多种途径促进AD的发生发展,降低RAGE的表达水平或者竞争性阻断RAGE与配体的相互作用可望成为延缓AD的治疗靶点。由于RAGE抗体及sRAGE难以通过血脑屏障,使其临床应用受到制约,研究新的小分子阻断RAGE作用的药物已成为必然趋势。1.本研究以大鼠海马注射AGEs的方法建立AGEs损伤模型,观察其对tau蛋白磷酸化、氧化应激和内质网应激相关指标的影响,进一步证明AGEs-RAGE通路在AD发病过程中有非常重要的作用。2.本研究在AGEs模型中探讨FPS-ZM1阻断RAGE与AGEs结合的脑保护作用,发现该药物对AGEs诱导的tau蛋白磷酸化、氧化应激和内质网应激的相关指标有明显的改善作用,提示FPS-ZM1是一种有效的小分子RAGE阻断剂,可望成为一种有潜力的AD防治药物。