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甘草(Glycyrrhiza)是中药处方中常用药材之一,自古有“十方九草”之称。甘草有效成分主要包括黄酮类、多糖类和三萜类等,其中多糖具有免疫调控、抗病毒、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等药理学作用。近年来研究发现,对多糖进行脂质体包裹,可以大大提高其生物学活性,尤其可以增强其免疫活性。本研究选择甘草多糖(Glycyrrhiza polysaccharide,GP)为研究对象,首先用分步醇沉法提取分级甘草多糖,分别测定其体外增强免疫的活性并筛选出效果较好的GP,再进一步进行脂质体包封,制备甘草多糖脂质体(Glycyrrhiza polysaccharide liposome,GPL),然后通过体内和体外试验测定了甘草多糖包封前后的对鸡的增强免疫活性的变化。本研究的目的旨在探讨甘草多糖脂质体对鸡的免疫增强活性,为脂质体应用于中药多糖及疫苗佐剂提供理论的依据。试验分为以下几个章节:试验Ⅰ 甘草多糖的制备 分别采用水提一步醇沉的方法和分步醇沉的方法从甘草饮片中分别提取得到甘草总多糖(GPt)和3种甘草分级多糖(GP30、GP50、GP80),分别采用苯酚-硫酸法及考马斯亮蓝法检测各甘草多糖的糖含量和蛋白质的含量。结果显示,各多糖中以甘草总多糖的提取率最高,达4.13%;分级多糖中以GP50提取率最高,为2.16%,其糖含量也最高,达到54.9%,说明GP50是多糖的主要集中组分。试验Ⅱ 甘草多精增强免疫活性部位的筛选 首先测定甘草总多糖GPt和3种甘草分级多糖GP30、GP50、GP80对鸡外周血淋巴细胞的安全浓度范围,其次取在安全浓度范围内的5个浓度的各多糖单独或与PHA一起,加入到淋巴细胞中,采用MTT方法测定淋巴细胞的增殖。结果显示,各多糖在合适的浓度均能单独或者协同PHA显著促进淋巴细胞的增殖,其中以GP50的作用最强,说明GP50是GP增强免疫活性最强的组分。试验Ⅲ 甘草多糖脂质体的制备 本章节选择免疫活性较好的GP50组分为研究对象,首先通过柱层析法对其进行再纯化,分别采用逆向蒸发法、乙醇注入法、薄膜分散法和硫酸铵梯度法制备GPL,微柱离心法分别测其包封率,比较此四种制备方法,筛选出逆向蒸发法为GPL最佳制备方法。再以GPL包封率和载药量为其考察的指标,考察了脂药比、膜材比、水浴温度、超声时间和吐温-80用量等5个单因素,进一步通过响应面法优化最佳制备条件,并对最佳制备工艺条件进行验证。经Design-Expert软件进行分析,得到GPL最佳制备条件为:脂药比24:1,水浴温度46℃,超声时间16min,依据最佳制备条件组合进行验证,所得GPL包封率为78.33±0.25%,粒径136.4±0.151 nm,形态均一。试验Ⅳ 甘草多糖及其脂质体促进鸡外周血淋巴细胞增殖的比较 将GPL、GP和空白脂质体(BL)分别用细胞培养液稀释成13个浓度,加入到鸡外周血淋巴细胞中,采用MTT方法测定它们的最大安全浓度范围;然后取安全浓度范围内5个浓度的GPL、GP和BL分别单独或者与PHA、LPS同时加入到鸡外周血淋巴细胞培养体系中,用MTT的方法检测淋巴细胞增殖的变化。结果表明,GPL和GP既能在一定的浓度范围内(最好写清楚浓度范围)单独显著促进淋巴细胞增殖,又能协同PHA显著促进T淋巴细胞的增殖或LPS显著促进B淋巴细胞的增殖,且GPL的作用多显著强于GP,说明脂质体能显著提高甘草多糖体外促进鸡淋巴细胞增殖的活性。试验Ⅴ 甘草多糖及其脂质体促进鸡树突状细胞增殖及功能的比较本试验旨在研究甘草多糖及其脂质体对树突状细胞增殖、成熟和分泌功能等影响的比较。将GPL与GP分别作用于鸡骨髓来源的树突状细胞,采用MTT法检测GPL和GP对鸡骨髓来源树突状细胞前体增殖的影响,树突状细胞促T细胞增殖的影响以及对树突状细胞分泌IL-2和IFN-γ因子的影响。表明,GP能够显著促进树突状细胞前体的增殖;经GP作用的树突状细胞,促T细胞增殖和抗原提呈功能均得到了显著改善;GP刺激后的树突状细胞,其分泌IL-2与IFN-γ均得到显著上调,且GP包封脂质体后的GPL,其功能显著提高。试验Ⅵ 甘草多糖及其脂质体增强鸡新城疫苗免疫效果的比较 本试验目的在于研究甘草多糖及其包被于脂质体后对鸡新城疫疫苗免疫效果的比较。12日龄蛋鸡210羽,随机分7组,30羽/组,除空白对照组外均用新城疫IV系苗进行滴鼻、点眼免疫,28日龄进行第二次免疫。在首免的同时,GPL的3个剂量组分别肌肉注射3种浓度的GPL1 ml,两个药物对照组分别注射GP和BL 1 ml,免疫组和空白对照组注射等量的生理盐水,每天1次,连续3天。于首次免疫后的第7d、14d、21d、28d、35d、42 d在鸡翼静脉处分别采血,测定血清抗体效价;于首免后第14 d、28 d、42 d心脏采血,测定T淋巴细胞增殖,并称体重;于首免后第42天测定胸腺、脾脏和法氏囊指数。结果表明,GPL和GP均能显著提高鸡新城疫疫苗的免疫效果,GPL的作用更强,脂质体能显著提高甘草多糖的免疫增强活性。