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目的:矽肺是由于在生产过程中长期吸入游离二氧化硅（Si O2）粉尘引起的以肺部弥漫性纤维化为主的全身性疾病。矽肺发病过程涉及多种细胞。其发病机制也是极其复杂。外泌体lncRNA在细胞间的通讯作用近年来得到了广泛的关注。然而其在矽肺的发病机制中发挥着怎样的作用,目前仍不明确。因此,本研究旨在明确矽肺患者血清外泌体lncRNA表达谱,探讨外泌体lncRNA MSTRG.91634.7在巨噬细胞和成纤维细胞间的通讯作用,探明lncRNA MSTRG.91634.7靶向PINK1对矽肺病理进程的调控机制,以期为阐明矽肺发病机制提供新的理论依据和潜在治疗靶点。研究方法:本研究通过收集矽肺患者和健康人外周血血清进行外泌体提取,利用透射电镜、粒径分析技术以及Western blot对外泌体进行鉴定;并对外泌体进行lncRNA测序;利用DESeq的方法进行差异表达lncRNA的筛选;利用生物信息学对差异表达lncRNA的靶基因进行功能的预测与分析;采用体外培养巨噬细胞,Si O2处理后,realtime-PCR法对差异表达的lncRNA进行验证。利用FISH对lncRNA MSTRG.91634.7在细胞中的表达进行定位;利用realtime-PCR法检测各细胞中lncRNA MSTRG.91634.7的表达情况;利用RNA Pull-Down技术验证lncRNA MSTRG.91634.7与PINK1的结合;通过建立THP-1与MRC-5的共培养系统,Si O2刺激下层巨噬细胞,利用realtime-PCR法检测成纤维细胞中lncRNA MSTRG.91634.7、PINK1以及各因子的转录水平;通过提取THP-1培养上清的外泌体,并与成纤维共培养,利用Western blot检测成纤维细胞中PINK1以及各纤维化指标的蛋白表达水平;通过转染搭载sh-PINK1的慢病毒构建体外成纤维细胞PINK1沉默模型,并且建立THP-1与MRC-5的共培养系统,通过realtime-PCR检测在Si O2处理巨噬细胞后,成纤维细胞中各lncRNA MSTRG.91634.7和PINK1生的表达水平;通过提取THP-1培养上清的外泌体,并与MRC-5共培养,利用Western blot检测成纤维细胞中PINK1以及各纤维化指标的蛋白表达水平。上述实验用来说明巨噬细胞外泌体lncRNA MSTRG.91634.7靶向PINK1抑制成纤维细胞活化。通过采用雄性C57BL/6小鼠经非暴露气管灌注矽尘悬液建立小鼠肺部纤维化模型,应用搭载了ov-PINK1的6型腺相关病毒建立小鼠肺部PINK1过表达模型。并将小鼠按体重随机分为六组:生理盐水组（control）;矽肺组（silica）;生理盐水空病毒组（control+AAV-NC）;矽肺空病毒组（silica+AAV-NC）;生理盐水过表达组（control+AAV-ov-Pink1）;矽肺过表达组（silica+AAV-ov-Pink1）。利用Western blot法检测PINK1蛋白水平上过表达效果,以及realtime-PCR法确认PINK1基因水平上过表达效果;利用HE染色观察每组小鼠肺部炎症细胞浸润以及肺泡壁的破坏;利用Elisa检测肺泡灌洗液中炎性因子IL-1β的表达水平。realtime-PCR法检测肺组织内炎性因子的转录水平;用Western blot对肺组织内各炎症纤维化指标的蛋白水平进行检测;利用免疫荧光和免疫组化检测56天肺组织内α-SMA和Col-3的表达水平;利用羟脯氨酸法检测小鼠肺组织中胶原的沉积。Masson染色观察小鼠肺组织切片中矽结节的形成以及胶原沉积。通过上述实验来证明过表达PINK1对矽尘导致的肺组织炎症纤维化的影响。结果:1、矽肺病患者和健康对照的基础特征。本次研究用于测序共3名矽肺病患者,均为Ⅰ期,同时选择3名接尘工人作为健康对照,患者年龄为55.3±1.5岁。对照年龄为56.3±0.5岁。t检验比较患者与对照组均数,无统计学差异。患者累计接尘时间为23.3±5.8,对照为36.7±1.2年,对照接触矽尘年限高于患者（P＜0.05）。2、矽肺患者外周血血清外泌体中差异表达lncRNAs的鉴定。通过与ensembl数据库的比对序列鉴定出12055个lncRNA,其中2685个序列与ensembl中的成熟lncRNA记录一致,而9370个序列无法与任何记录配对,被鉴定为预测的lncRNA。为了进一步探讨检测到的lncRNA的作用,我们在矽肺组和对照组之间比较了它们的表达,发现27个lncRNA差异表达,其中16个lncRNA上调,而11个lncRNA下调。此外,分层聚类结果表明,具有相同组的样本分配或具有相同调节模式的lncRNA分别聚集在一起。主成分分析表明,前两个成分的总体解释率为26.67%,同一组内任意两个样本之间的相关系数均大于0.5,表明同一组内的样本具有高的解释性、连贯性。3、LncRNA表达水平验证。采用realtime-PCR的方法检测各个lncRNA在人巨噬细胞中的表达水平。结果表明其中与测序结果一致的为:MSTRG.91634.7、MSTRG.43085.16（P＜0.05）。4、LncRNA MSTRG.91634.7在细胞中的定位及其与靶基因PINK1的结合。利用realtime-PCR检测lncRNA MSTRG.91634.7在成纤维细胞、巨噬细胞和上皮细胞中的表达情况。结果发现在巨噬细胞中表达量最高。利用荧光原位杂交技术检测lncRNA MSTRG.91634.7在巨噬细胞中的定位,主要表达在细胞核中。利用RNA Pull-Down来检验lncRNA MSTRG.91634.7与PINK1的结合,结果表明,lncRNA MSTRG.91634.7可以和PINK1结合。5、外泌体lncRNA MSTRG.91634.7可调节PINK1表达和成纤维细胞活化。建立了THP-1与MRC-5的transwell共培养体系。并且利用腺病毒对THP-1进行lncRNA MSTRG.91634.7过表达,用二氧化硅进行刺激,共培养24h后,收集上层小室内成纤维细胞。Realtime-PCR检测lncRNA MSTRG.91634.7及其靶基因PINK1和纤维化相关的基因表达水平,Si O2组lncRNA MSTRG.91634.7及其靶基因Pink1表达降低,纤维化指标Tgf-β1、Col1表达明显升高;而Si O2-ov-lncRNA组lncRNA MSTRG.91634.7及其靶因Pink1明显回升高,纤维化指标Tgf-β1、Col1表达水平明显下降（P＜0.05）。将各组外泌体与成纤维细胞共培养24后收集各组细胞提取蛋白,检测蛋白水平的变化。结果发现Si O2组PINK1表达降低,纤维化指标TGF-β1、COL-1表达明显升高;而Si O2-ov-lncRNA组PINK1水平明显回升高,纤维化指标TGF-β1、COL-1表达水平明显下降（P＜0.05）。6、外泌体lncRNA MSTRG.91634.7靶向PINK1抑制成纤维细胞活化。收集各组巨噬细胞培养上清,提取外泌体,与成纤维细胞进行共培养24h后,收集各组成纤维细胞。Realtime-PCR检测成纤维细胞中lncRNA MSTRG.91634.7、PINK1以及纤维化指标的变化。Exo Si O2组lncRNA MSTRG.91634.7水平明显降低,当过表达lncRNA MSTRG.91634.7后,exoov-lncRNA-Si O2组lncRNA MSTRG.91634.7水平有所回升,而exoov-lncRNA-Si O2+sh-PINK1组过表达lncRNA MSTRG.91634.7后,lncRNA MSTRG.91634.7并没有升高。Exo Si O2组Pink1水平明显降低,当过表达lncRNA MSTRG.91634.7后,Pink1明显回升,而exoov-lncRNA-Si O2+sh-PINK1组,即使过表达lncRNA MSTRG.91634.7后,也并未使得PINK1基因水平有所回升。在蛋白水平上,exo Si O2组PINK1蛋白水平明显降低,TGF-β1、FN-1明显升高;当过表达lncRNA MSTRG.91634.7后,PINK1蛋白水平明显回升,TGF-β1、FN-1也随之降低,纤维化减轻,而exoov-lncRNA-Si O2+sh-PINK1组,在过表达lncRNA MSTRG.91634.7后,并未使得PINK1升高,同时TGF-β1、FN-1水平也未降低,纤维化并未减轻（P＜0.05）。7、过表达PINK1可减轻矽尘暴露导致的小鼠肺组织炎性因子的表达。利用ELISA法测量了7天各组小鼠肺泡灌洗液中炎性因子IL-1β的分泌情况,并使用realtime-PCR法和Western blot测量小鼠肺组织匀浆中炎性因子的m RNA转录水平和蛋白表达水平。ELISA结果表明,在矽尘暴露组,小鼠肺泡灌洗液中炎性因子IL-1β有明显的升高（P＜0.05）;与矽肺组小鼠相比,IL-1β在过表达PINK1矽肺组小鼠肺泡灌洗液中的含量明显降低（P＜0.05）。Realtime-PCR检测结果显示:矽肺组小鼠IL-1β和NLRP3的m RNA转录水平明显增加（P＜0.05）;与矽肺组小鼠相比,IL-1β和NLRP3的m RNA转录水平在过表达PINK1矽肺组小鼠肺组织匀浆中明显降低（P＜0.05）。Western blot结果与realtime-PCR检测结果一致。8、过表达PINK1可减轻矽尘暴露导致的小鼠肺组织炎症。对造模后7天的各组小鼠肺组织石蜡切片进行HE染色。HE染色结果显示,与生理盐水组的小鼠相比,矽肺组小鼠肺组织出现炎性细胞出现大量浸润,肺泡壁破坏明显。过表达PINK1可明显减轻矽尘诱导的小鼠肺部炎性改变。各组的小鼠肺照片显示:矽肺组小鼠肺组织损伤明显,过表达PINK1可减轻由矽尘导致的肺部炎症。矽肺组小鼠肺重体重比显示:矽肺组小鼠肺重体重比有明显增加,过表达PINK1后可以明显降低小鼠肺重体重（P＜0.05）。利用吉姆萨染色对各组小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞进行了计数。结果显示,矽肺组小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞数量显著增多,过表达PINK1后可以明显减少小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞的数量（P＜0.05）。9、过表达PINK1可减轻矽尘导致的小鼠肺组织纤维化。利用realtime-PCR法和Western blot法测量小鼠肺组织匀浆中肺组织纤维化相关指标的m RNA转录水平和蛋白表达水平。Realtime-PCR结果显示,与生理盐水组相比。矽肺组小鼠肺组织匀浆中TGF-β1、COL-3、FN1的m RNA转录水平明显升高,而过表达PINK1后,TGF-β1、COL-3、FN1的m RNA转录水平显著降低（P＜0.05）。Western blot法结果显示,与生理盐水组相比,矽肺组小鼠肺组织匀浆中TGF-β1、COL-1的蛋白水平显著升高,而过表达PINK1矽肺组小鼠肺组织匀浆中TGF-β1、COL-1的蛋白水平明显降低（P＜0.05）。利用免疫荧光和免疫组化法检测小鼠矽尘暴露晚期（56天）肺组织分泌α-SMA和COL-3的情况,支持realtime-PCR法和Western blot法的结果。Masson染色和羟脯氨酸试剂盒检测小鼠肺组织胶原沉积情况。Masson染色结果揭示:在矽尘暴露晩期（56天）,矽肺组小鼠肺组织胶原沉积现象较为严重。与矽肺组小鼠相比,过表达PINK1矽肺组小鼠肺组织胶原沉积明显减少。羟脯氨酸测量结果表明:在矽尘暴露晚期（56天）,羟脯氨酸测量结果表明:矽肺组小鼠肺组织内羟脯氨酸含量明显增加（P＜0.05）;表达PINK1后,可以明显减少小鼠肺组织内羟脯氨酸的含量（P＜0.05）。各组的小鼠肺照片显示:与生理盐水组相比,过表达PINK1生理盐水组小鼠肺部无改变,矽肺组小鼠肺组织损伤明显,过表达PINK1可减轻由矽尘导致的肺部纤维化。结论:1、矽肺患者外周血外泌体lncRNA MSTRG.91634.7低表达。2、外泌体源性lncRNA MSTRG.91634.7可靶向PINK1抑制成纤维细胞活化。3、过表达PINK1可缓解矽肺小鼠炎症纤维化的发生发展。