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第一、二部分Wiskott-Aldrich综合征患儿CD19共受体信号介导的记忆B细胞早期活化异常WAS综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)是一种罕见的原发性免疫缺陷疾病,表现为自幼发病的湿疹、血小板减少和出血“三联征”,易患自身免疫性疾病和肿瘤。如不尽早进行干细胞移植或基因治疗重建免疫患儿不能正常存活。WAS患者记忆B细胞体内增殖能力受损。然而具体的分子机制还未明确。我们收集WAS患者和正常同龄对照儿童外周血单个核细胞标本,用TIRFm技术研究WAS患者幼稚B细胞和记忆B细胞的早期活化事件,以期对其分子机制有所认识。抗原刺激后B细胞快速形成BCR聚集簇和细胞扩张,是记忆B细胞能够迅速激活并发挥免疫效应的活化早期关键事件。对照组记忆B细胞比幼稚B细胞能更快地形成BCR聚集簇,细胞扩张能力更强。而这些关键事件在WAS患者记忆B细胞中是异常的。机制研究发现WAS患者记忆B细胞BCR信号的正向调控分子CD19-Btk信号降低且负向调控分子FcγR IIB-SHIP-1信号增强。进一步研究发现WAS蛋白促进CD19转录水平,可以解释WAS突变CD19共受体信号介导的记忆B细胞早期活化异常。第三部分Mst1通过CD19共受体转导信号正向调节B细胞受体信号作为Hippo信号通路的关键调节因子,Mst激酶是一个新兴的关键信号分子,影响细胞的增殖、器官大小、细胞迁移和细胞极性。Mst1缺乏导致边缘区(MZ)B淋巴细胞发育缺陷。但Mst1如何调节B细胞受体(BCR)的活化和B细胞分化尚未有报道。利用转基因小鼠模型和膜相关抗原-TIRFm体系,本研究发现Mst1缺陷B细胞在膜相关抗原刺激后B细胞早期活化关键事件—BCR聚集簇形成障碍,B细胞扩张受限,这可以解释Mst1基因缺陷小鼠B细胞受体信号降低的现象。进一步研究发现Mst1通过调节BCR共受体CD19的基因转录水平正向调控BCR信号通路。而且Mst1缺陷导致CD19共受体信号介导的Btk信号减弱,进而导致小鼠脾脏边缘区B细胞(MZB)和生发中心B细胞(GCB)分化严重受损。进一步机制研究发现,Mst1通过转录因子-TEAD2直接结合cd19 3’UTR的共识基序(consensus motif)来上调CD19的m RNA水平。因此,本研究揭示了Mst1调节外周B细胞的活化和分化的一个新机制。第四部分中国15例RAG基因突变致患儿的临床、免疫和基因特征目的:重组激活基因1和重组激活基因2(Recombination Activating Genes;RAG1,RAG2)对T和B淋巴细胞的发育和功能起关键作用。其编码的RAG1/2酶活性缺失往往导致典型严重联合免疫缺陷症(severe combined immunodeficiency,SCID)和Omenn综合征(Omenn syndrome),病情重,若不及时免疫重建,患儿多1岁内死亡,死亡率极高。RAG突变导致的中国SCID和OS患儿的临床、免疫和RAG突变遗传特性还没有详细的研究报道。本文将探讨中国大陆15例RAG1/2基因缺陷患儿的临床表现,评估免疫功能。方法:收集2008年-2015年疑诊RAG1/2缺陷患儿及家系标本,经PCR方法扩增RAG1/2基因,均通过查询千人数据库及NCBI db SNP库排除SNP,并通过mutation taster和poly-phen软件预测致病可能性;Swiss model预测RAG1/2结构变化;经TRECs和TCRvb评估TCR组装、发育及T细胞增殖实验评估T细胞功能;精细免疫分型分析T/B淋巴细胞各亚群水平;T+B-NK+表型患儿经STR分析是否有母体T细胞植入。结果:本研究经临床表型、免疫学筛查和基因分析,本研究确诊15例RAG1/2基因缺陷患儿,其中RAG1基因缺陷13例,RAG2基因缺陷2例;检测出22个RAG基因突变,其中新发致病突变14种,包括10种RAG1新发突变(R108X、M630T、E510X、S666P、E669K、C730Y、A857V、K847E、L922Pfs X7和L1025Ffs X39)和4种RAG2新发突变(R73C、I427Gfs X12、P432L和311ins L)。在中国人群,L1025Ffs X39是一个潜在的RAG1热点突变。本研究发现RAG1基因突变的分布而不是突变类型在SCID和OS患者有所差异。尽管OS患儿T细胞数量正常或升高,但TCR受体多样性、TCR基因重排、胸腺输出和T细胞增殖严重受损,提示T淋巴细胞发育和功能严重受损。结论:本研究发现目前中国大陆最大的RAG1/2缺陷致SCID的病例库之一,丰富了临床及免疫资料,为进一步认识RAG1/2缺陷,早诊断早治疗提供依据。新生儿TRECs筛查是早期发现SCID的有效手段,可避免减毒活疫苗接种引发的疫苗相关疾病;对有明确家族史者,产前诊断可避免RAG1/2缺陷患儿出生。这些研究结果将对SCID和OS的早期诊断和治疗有一定的帮助。