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研究背景PD-L1是属于免疫球蛋白B7-H家族的免疫信号蛋白分子,通过与表达在活化的T细胞表面的PD-1相互结合,从而抑制效应性T细胞的功能,使肿瘤细胞逃逸免疫系统的杀伤。研究表明,在多种癌症如乳腺癌、肝癌、黑色素瘤、胃癌等中,PD-L1的表达上调都与患者的不良预后密切相关。针对PD-L1的单克隆抗体也已被应用于多种癌症的临床治疗。目前关于PD-L1的抗癌效应研究主要集中于PD-L1通过抑制T细胞的免疫杀伤功能导致免疫抑制方面。新近研究结果提示,PD-L1还具有促进肿瘤细胞增殖和侵袭转移、诱导自噬、调节代谢等多种与肿瘤的发生发展密切相关的生物学功能,相关的分子机制有待明确。NF-κB信号通路参与多种疾病进程,尤其在炎癌转化中发挥重要作用。研究表明,通过调节NF-κB信号通路的活性可以提升药物对癌症的治疗效果,因此NF-κB可作为潜在的重要药物作用靶点。NF-κB信号通路的激活的重要方式包括其组分转录因子P65位于536位苏氨酸的磷酸化。磷酸化后的P65入核能力增加,作为转录因子参与多种基因的转录调控,包括c-myc,cyclinD1,bcl-2家族,IAPs基因家族和TRAF基因家族等,从而促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。胃癌在癌症中的致死率位居第五,亚洲是胃癌的多发区。胃癌患者的预后极差,五年生存期不足25%。胃癌发生与胃部炎症密切相关。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染是炎癌转化的一个重要病原因素,因此幽门螺杆菌已被世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)列为Ⅰ类致癌物。全世界人口感染幽门螺杆菌比例超过50%,在我国,这一比例可以达到80%。作为一个慢性、长期、多级的过程,幽门螺杆菌诱导的炎癌转化过程中,幽门螺杆菌及其毒力因子CagA能够激活细胞内多种促癌的信号通路和相关致癌因子。因此,对幽门螺杆菌相关NF-κB信号通路与PD-L1相互作用参与炎癌转化的作用机制进行深入探讨,可更好地理解幽门螺杆菌的致病性,同时具有潜在的的临床应用价值。研究目的解析PD-L1与P65的相互作用在幽门螺杆菌诱导的胃癌发生过程中促进细胞恶性转化的调控机制,为研究胃癌发生机制,提供潜在的治疗靶点提供一定的理论依据,并且对PD-L1在炎癌转化过程中不依赖于PD1的促进细胞增殖的新功能进行探讨。研究方法和结果1.PD-L1在人体胃癌病理组织标本中表达上调。分别使用qRT-PCR、Western-blot、免疫组化染色,检测PD-L1在人体胃部炎症和癌症病理组织标本中的表达情况。结果表明,与胃部炎症组织标本相比,PD-L1的RNA和蛋白表达水平在胃部癌症组织标本中有显著的上调。2.PD-L1在胃癌细胞系中促进胃癌细胞增殖。对胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901分别转染PD-L1的特异小干扰RNA和高表达质粒及相应的空白对照,通过克隆形成实验、EDU实验检测细胞增殖能力。实验结果表明,转染PD-L1特异小干扰RNA抑制PD-L1表达后,BGC-823细胞的增殖能力明显下调;而转染PD-L1的高表达质粒过表达PD-L1后,SGC-7901细胞的增殖能力明显上调。3.PD-L1能与SHP-2结合激活其下游的多条信号通路。分别对胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901转染PD-L1的特异小干扰RNA和高表达质粒及相应的空白对照,检测下游相关信号通路及关键信号分子的变化。实验结果表明,转染特异小干扰RNA抑制PD-L1表达后,BGC-823细胞中p-P65、p-ERK、p-Jun表达水平也随之下调。与此同时,转染PD-L1高表达质粒可使SGC-7901细胞中PD-L1的表达水平明显上调,p-P65、p-ERK、p-Jun表达水平也随之上调。这一结果提示PD-L1可激活NF-κB信号通路、MEK/ERK信号通路以及MAPK信号通路。对PD-L1和幽门螺杆菌毒力因子CagA的接头蛋白SHP-2进行蛋白质免疫共沉淀检测,实验结果表明,PD-L1与SHP-2之间存在相互结合,从而激活SHP-2下游的多条信号通路,因此幽门螺杆菌可能通过PD-L1对p-P65进行调控。4.PD-L1受到P65直接调控。分别对胃癌细胞系BGC-823和SGC-7901转染P65的特异小干扰RNA和高表达质粒及相应的空白对照,检测PD-L1的表达水平。实验发现,转染了 P65的特异小干扰RNA抑制P65后,BGC-823细胞中PD-L1的表达水平明显下调;而转染P65高表达质粒使P65增强后,SGC-7901细胞中PD-L1的表达水平明显上调。为进一步验证P65是否能够直接调控PD-L1,构建PD-L1启动子-荧光素酶报告基因载体,双荧光素酶实验显示,p65能够结合到PD-L1的启动子上并激活其表达。5.幽门螺杆菌通过激活NF-κB信号通路上调PD-L1的表达。分别在AGS与BGC-823细胞系中加入Hp标准株26695,在分别感染细胞2h、4h、6h、8h之后,通过Western bolt和qRT-PCR检测PD-L1的表达情况,发现PD-L1在蛋白和RNA水平表达均有上调。在AGS与BGC-823细胞系中分别加入AKT、MAPK、SRC、NF-κB、MEK/ERK信号通路的抑制剂,在Hp26695感染后,通过Western blot检测PD-L1的表达情况,发现加入NF-κB抑制剂可以显著抑制PD-L1在蛋白水平的表达,推测Hp可以通过NF-κB信号通路对PD-L1进行调控,并通过PD-L1调控p-P65。研究结论1.PD-L1与SHP-2结合,促进下游多条促癌信号通路的激活,从而促进胃癌细胞的增殖。2.P65被磷酸化入核后,能够直接结合PD-L1基因的启动子,上调其表达。3.幽门螺杆菌感染可以促进PD-L1与P65的相互作用,从而促进胃癌发生。