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异丁醇作为一种新型的生物燃料，已经受到学术界和工业界人士的关注。异丁醇比乙醇有更高的辛烷值和能量密度。另外，异丁醇与汽油具有相似的吸收性、能量密度和辛烷值，可在现有的基础设施中使用。目前，多数微生物对醇类有较低的耐受性，异丁醇的产率很难大幅度提高。但是，酿酒酵母发酵合成乙醇已经工业化生产，对醇类有很高的耐受性，并且，酿酒酵母在酸性环境下具有稳定性和耐受性。酿酒酵母作为细胞工厂的研究平台，基因测序已经完成，拥有比较成熟的DNA重组技术。因此，可以通过DNA重组技术改进酿酒酵母生产异丁醇的能力。 本研究以实验室保藏的酿酒酵母W303-1A为出发菌，通过DNA重组技术，构建酿酒酵母合成异丁醇的研究平台，提高酿酒酵母发酵异丁醇的产率。根据酿酒酵母生物合成异丁醇的代谢途径和前体丙酮酸代谢去向分析，分别通过以下四种途径来研究：第一，利用两步基因置换法过量表达编码分枝氨基酸转氨酶 BAT2，提高异丁醇合成通量。第二，利用一步基因置换法缺失编码内源性的丙酮酸脱羧酶PDC6，减少乙醇的生物合成。第三，利用一步基因置换法缺失编码二氢硫辛酸脱氢酶LPD1，减少丙酮酸合成乙酰CoA。第四，利用构建的表达质粒 YEplac181-PGK1p-ILV2和YEplac195-ILV3p-PGK1p-ILV3，过量表达编码乙酰乳酸合酶的ILV2和2-羟异戊酸脱水酶ILV3，提高缬氨酸代谢通量。其中，突变株HZAL-2(PGK1p-BAT2)中过量表达了BAT2；突变株HZAL-7(PGK1p-BAT2 pdc6::R)中过量表达了BAT2，缺失了PDC6；突变株HZAL-12(PGK1p-BAT2 lpd1::RYUR)中过量表达了BAT2，缺失了LPD1；突变株HZAL-11(PGK1p-BAT2 lpd1::RYUR pdc6::R)中过量表达了 BAT2，缺失了 LPD1和PDC6。 经过基因修饰后的酿酒酵母菌进行厌氧发酵试验。突变株HZAL-7(PGK1p-BAT2 pdc6::R)[YEplac181-PGK1p-ILV2/YEplac195-ILV3p-PGK1p-ILV3]，相对于对照菌株异丁醇的产率提高11.4倍。而突变株 HZAL-12(PGK1p-BAT2 lpd1::RYUR)[YEplac181-PGK1p-ILV2]相对于对照菌株异丁醇的产率提高8.8倍；缺失PDC6基因的突变株HZAL-11(PGK1p-BAT2 pdc6::R)[YEplac181-PGK1p-ILV2]相对于对照菌株异丁醇产率提高13.6倍。 结果表明：通过DNA重组技术修饰特定基因减少乙醇和乙酰CoA生物合成，提高酿酒酵母合成异丁醇的产率具有一定的可行性，对了解异丁醇的生物合成的分子机制的研究提供重要参考价值。