论文部分内容阅读
研究背景:随着当代社会节奏的加快,各种烧伤创伤经常出现,人口逐渐趋于老年化,糖尿病、放射性治疗、压力大等引起的慢性溃疡发病率明显增加,且创面愈合的病程也会增长。因此,越来越多的研究开始重点关注创面愈合。积雪草苷霜软膏的有效成分是从伞形科积雪草的全草中提取出来,已应用于临床上手术创伤、烧伤、外伤的治疗,具有促进创伤愈合的作用。积雪草苷促进创面愈合的确切机制尚未明确,但这方面的研究已成为学者们关注的热点,特别是其促进烧伤创面愈合的分子机制的研究。目的:为了进一步深入研究积雪草苷在促进烧伤创面愈合的分子机制,观察在积雪草苷作用下,烧伤创面愈合过程中细胞周期蛋白(Cyclin)及增殖细胞核抗原(PCNA)表达的变化以探讨其对细胞增殖的作用机制,并通过研究积雪草苷对烧伤创面组织的炎症因子及NF-κ B信号通路的影响情况以探讨其抑制炎症的作用机制。方法:第一部分:建立深Ⅱ°烫伤动物模型72只,采用对照的方法,将大鼠的创面根据不同处理方式分为两组,分别为积雪草苷用药组和对照组,观察并记录创面愈合情况,取伤后第1、3、7、11、14、17天创面标本,分别行HE染色和免疫组织化学染色,以观察细胞增生情况和CyclinB1、CyclinC、CyclinD1、PCNA表达情况。两组创面采用配对资料t检验,P<0.05为差异有统计学意义。第二部分:取Wistar大鼠深Ⅱ°烫伤动物模型创面组织细胞进行细胞培养,取培养所得细胞,经胰蛋白酶消化后分为4组:对照组(未加药物)和三个不同剂量积雪草苷药物组,每组均以2～3 ×104个/mL的密度接种于96孔板,每组8孔,其中空白组不加药物,三个药物组积雪草苷终浓度分别为10-7、10-6及10-mnol/mL,所有细胞分组处理后培养12h。应用MTT法检测积雪草苷对烫伤上皮组织细胞增殖的影响,应用免疫组织化学检测创面上皮组织巨噬细胞的数量,应用ELISA检测上清液中TNF-α、IL-1及IL-10的表达情况:应用Western blot法检测创面组织中NFkBP65蛋白表达;应用激光共聚焦显微镜检测NF-K B的活化情况(主要亚基p65转运到细胞核内情况)。结果:第一部分:①创面愈合时间:72例Wistar大鼠深11°烫伤模型建立成功,创面愈合时间方面,积雪草苷治疗组的愈合时间为(17.40±3.15)d;明显早于非药物对照组的(22.17±4.02)d,其中对照组还出现1例因创面感染在25 d才完全,两组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。②HE染色:积雪草苷治疗组于第3天可见明显增生的表皮细胞,而对照组至第7天可见明显增生的表皮细胞。③伤后第1、3、7、11、14、17天创面标本免疫组织化学染色结果显示,积雪草苷组CyclinB1、PCNA表达均明显高于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05),而Cycl inC、CyclinD1表达差异无统计学意义(P>0.05)。第二部分:①通过MTT法检测细胞生长情况:与对照组相比,积雪草苷三个剂量组对细胞增殖均无显著影响(P>0.05),表明上述浓度的积雪草苷对上皮组织细胞无细胞毒性作用,具有一定的安全性。②积雪草苷治疗组第3、7、1 1、14天创面浸润巨噬细胞数量均少于对照组。③ELISA检测上清液中TNF-α、IL-1及IL-10的表达:与空白组的比较,积雪草苷在各个剂量组中都不同程度的抑制了TNF-α以及IL-1的过高表达(P<0.05),且各积雪草酸组中随着浓度的增加,TNF-α及IL-1的表达呈下降趋势;积雪草苷各剂量组IL-10的表达则明显高于空白组,随剂量增加呈上升趋势。④WB法检测伤后第7天创面组织中NFkBP65蛋白表达,积雪草苷组低于对照组。⑤激光共聚焦显微镜下观察NF-κB核转运情况:空白组阳性细胞百分率为(80.20±8.11)%,红染p65亚基主要集中在胞核,说明p65亚基转运入核明显;积雪草苷各剂量组p65转运入核的细胞百分率明显降低,呈剂量依赖性,四组之间的差异有统计学意义(F=F=24.172,P<0.001);与对照组相比,积雪草苷10-6moL/mL组(t=3.535,P=0.001)和积雪草苷10-5moL/mL组(t=6.675,P<0.001)差异有统计学意义。结论①积雪草苷可通过提高CyclinB1、PCNA的表达促进烧伤创面的愈合。了解积雪草苷促进烧伤创面的愈合机制,可以有针对性的联合其他药品,共同用药,几种药物效果叠加,充分利用不同的促进愈合机制,整体加速创面的愈合,缩短愈合时间。②积雪草苷可通过抑制NF-κB主要亚基p65蛋白的核转运来抑制炎症反应的过度表达。了解积雪草苷抑制炎症反应的机制,结合烧伤创面炎症反应的时间特点,在创面的炎症期,有针对性的使用,可以减轻创面炎症反应,促进创面愈合,缩短愈合时间。③积雪草苷应用于烧伤创面的治疗具有实用性,在烧伤创面早期即可以使用。创新性:对积雪草苷促进烧伤创面愈合和发挥抗炎作用的分子机制进行了研究,对其在烧烫伤创面开始使用的时间进行了预判断。从促进创面愈合,缩短愈合时间这一根本问题在临床上的使用,提供了理论依据。