阿尔茨海默病是一种神经退行性疾病,其发病机制有多种学说,其中淀粉样级联学说是主流学说之一。根据淀粉样级联学说,跨膜前体蛋白经剪切可形成含有38~43个氨基酸的淀粉样β蛋白(Aβ)。当Aβ42浓度达到一定程度时,聚集形成寡聚体以及纤维,引起神经突触损伤和炎症发生,导致阿尔茨海默病。其中,Aβ42聚集形成的寡聚体是引起神经细胞毒性的首要原因。因此,抑制Aβ42寡聚体形成或清除Aβ42寡聚体进而阻止其神经细胞毒性,对预防与干预阿尔茨海默病具有重要意义。本实验利用硫磺素-T(Th T)荧光法、SDS-PAGE、原子力显微镜(AFM)扫描等方法对Aβ42聚集过程进行研究,可以看到Aβ42在25℃的10m M PBS(p H=7.4)溶液的寡聚化条件下主要形成二聚体、四聚体、高聚体,而在37℃的10m M HCl(p H2.0)溶液的纤维化条件下可迅速形成纤维,且随时间增加而延长。其中,Th T方法的突出优点是方便、快捷、且灵敏度高,常常被用于从化合物库中高通量筛选可抑制Aβ42聚集的活性化合物。但Th T荧光法并不能区分出Aβ42聚集混合物中的单体、二聚体、四聚体和高分子量寡聚体及Aβ42纤维。SDS-PAGE可有效分离和显示Aβ42形成的各种聚集体,而且可定量分析各种聚集体的变化,是对Th T荧光法的重要补充。AFM方法可测定Aβ42聚集形成的不同颗粒的数量、高度和二维直径与面积,并且与SDS-PAGE电泳中的不同条带之间形成对应关系。本文分析了三种实验方法及其结果,综合反映出Aβ42蛋白聚集过程的变化趋势、各种寡聚体和聚集物的数量及其颗粒的形态变化等,为在体外研究Aβ42聚集形成规律提供了方法。在前期研究中,我们通过Th T荧光法从内生真菌Nodulisporium sp.(No.65-17-2-1)的次生代谢产物筛选出两种结构相似的类黄酮化合物---Demethoxyviridin(Dmv)和Inoterpene B(Inp B),测定Dmv抑制Aβ42聚集活性,其IC50为13.4μM,表明Dmv可能具有抑制Aβ42聚集的活性。本文进一步采用SDS-PAGE和AFM观察方法,研究Dmv和Inp B对Aβ42寡聚化过程的影响。加入Dmv后,可明显降低Aβ42在25℃的PBS溶液聚集过程中的Th T荧光值;SDS-PAGE电泳显示Aβ42单体、二聚体、四聚体和高聚体明显减少,而上样孔内出现更多的不能进入浓缩胶的染色物质;同时,AFM测定颗粒高度大于8nm的无定形大分子聚集物显著增多。而与仅含Aβ42的溶液相比较,Inp B对Aβ42的寡聚化过程几乎没有影响。因此,Dmv在25℃的PBS中促进二聚体、四聚体和高聚体进一步快速聚集成无定形的大分子聚集物。我们进一步研究了Dmv和Inp B对Aβ42纤维化过程的影响。当加入不同浓度Dmv后,可明显降低Aβ42在HCl溶液聚集过程中的Th T荧光值;SDS-PAGE电泳显示Aβ42单体、二聚体和四聚体明显减少,高聚体有所增多,而上样孔内染色物质的数量没有增加;AFM观察到Aβ42纤维的数量和长度都没有明显的改变。当将HCl溶液替换为37℃的纯水(p H=7)后,Dmv也可明显降低Aβ42聚集过程的Th T荧光值;SDS-PAGE显示Aβ42单体、二聚体和四聚体明显减少直至基本消失,高聚体先增加后减少,上样孔内染色物质的数量逐渐增加;AFM可以观察到Aβ42形成了短纤维和大分子聚集物。因此,Dmv在37℃的纯水中可促进Aβ42寡聚体形成短纤维和大分子聚集物。综上所述,Dmv可促进Aβ42寡聚体形成大分子聚集物或短纤维,减少具有神经细胞毒性的寡聚体,从而可能发挥保护神经细胞的作用,为阿尔茨海默病干预和预防研究提供潜在的候选化合物。