一、研究背景传统的观点认为肿瘤的发生是一个多步骤的过程,涉及到外界因素的刺激、癌基因的激活、抑癌基因的失活等一系列的过程。但人们在研究大肠癌时发现,肠道上皮细胞存活期短,没有足够的时间积累基因突变引起肿瘤,因此研究人员把目光投入到能够长期存在未分化的干细胞而不是已分化的肿瘤细胞。1997年Bonnet等分离出人急性粒细胞白血病干细胞,发现仅占0.2%的具有CD34+CD38-表型的肿瘤细胞能够使NOD/SCID小鼠体内形成瘤,而其它表型的大部分细胞无法形成肿瘤。2001年Reya等首次提出了肿瘤干细胞(TSC)学说,认为肿瘤组织中存在少量具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能的肿瘤干细胞,它在肿瘤组织中所占比例虽然很少,却与肿瘤起源、发展、转移、放化疗抵抗关系密切,而其它大部分肿瘤细胞经过几代短暂的分化后最终死亡。随后陆续在大肠癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等各种实体肿瘤中培养出肿瘤干细胞,并对其细胞标记物、生物学特性进行了研究。现在比较公认的脑肿瘤干细胞(BTSCs)表面标记物是细胞表面粘附分子CD133。Singh等培养出神经干细胞球,接种100个CD133阳性细胞使NOD/SCID小鼠致瘤,所形成的肿瘤与原肿瘤表型一致。但随着肿瘤干细胞研究的进展,研究人员发现CD133作为肿瘤干细胞具有一定局限性。Myung和Woolard等研究发现大约40%新鲜分离的胶质母细胞瘤标本并不表达CD133阳性肿瘤细胞；Wang等发现胶质瘤中存在部分CD133阴性的肿瘤细胞仍具有致瘤性,在此研究中发现CD133阴性细胞具有分化为CD133阳性细胞的能力,因此认为此类CD133阴性细胞也为脑肿瘤干细胞(BTSCs).2011年Rath,P等培养鉴定出脑膜瘤干细胞,并对其表面标记物进行了研究,认为CD133并非仅有的脑肿瘤干细胞的标记物,白细胞粘附因子CD166也是一种有价值的干细胞标记物。脑膜瘤是一种常见的颅内肿瘤,约占颅内肿瘤的20%,以手术治疗为主,90%脑膜瘤为WHO Ⅰ级,WHO Ⅱ脑膜瘤约占4.6%-7.2%,WHOⅢ脑膜瘤约占1%-3%。脑膜瘤的术后复发和转移是影响患者预后的关键。脑肿瘤干细胞标记物CD133及CD166为抗肿瘤治疗提供了新思路和可能的治疗靶点。前期大量的文献证实,CD133和CD166表达水平和多种肿瘤预后密切相关,是肿瘤预后相关因素之一。本研究应用免疫组织化学法检测脑膜瘤组织中干细胞标记物CD133和CD166的表达,探讨肿瘤组织中CD133和CD166阳性细胞分布情况和临床意义,以及CD166作为脑膜瘤干细胞的标记物的可行性。二、研究目的本研究采用免疫组化学技术,对比观察CD133与CD166在不同级别脑膜瘤中的表达,探讨两者相关性及临床意义,为脑膜瘤诊断、治疗寻找更好的靶点。三、实验过程1材料和方法1.1临床资料80例脑膜瘤样本来源于珠江医院病理科2006年至2009年保存的石蜡标本。均经病理学专家确诊,按照WHO(2007)脑肿瘤分类标准进行分类、分级,其中Ⅰ级脑膜瘤33例；Ⅱ级44例,其中非典型脑膜33例,其它11例；Ⅲ级3例,均为间变性脑瘤。按级别分为两组,Ⅰ级脑膜瘤为低级别,Ⅱ-Ⅲ级脑膜瘤为高级别。1.2试剂及免疫组化方法CD166兔抗人多克隆抗体(北京博奥森公司),CD133兔抗人多克隆抗体(北京中杉金桥公司),及免疫组化试剂盒(Biogenex公司)。标本经10%福尔马林溶液固定,石蜡包埋,切片的厚度为5um,脱蜡水化,修复抗原。操作严格按照说明书进行。每批染色以结肠癌标本作为CD133和CD166的阳性对照,以PBS液代替一抗体作为阴性对照。1.3结果判断标准CD133及CD166阳性表达为定位于细胞膜及细胞质,出现棕黄色且高出背景色。肿瘤组织的整体阳性表达程度用棕黄色物质的积分光密度(IOD)值表示。图像定量分析的过程：高倍镜(400×)下随机选择10个视野,使用Image-Pro Plus6.0病理图像分析软件计算出阳性细胞IOD值。2实验步骤石蜡切片经过脱蜡和水化后,对组织进行高压锅热修复。自然状态下冷却,蒸馏水冲洗2次,每次5min,用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline, PBS)浸泡3次,每次5min。使用吸水纸吸除残留载玻片PBS缓冲液后,加入3%过氧化物阻断剂(Hydrogen Peroxide Block)50-100μl,阻断灭活内源性过氧化物酶,室温孵育l0min。PBS液中冲洗3min×3次；甩去PBS液,滴加强力阻断剂5%牛血清,室温孵育10min；用力轻甩去非免疫性牛血清封闭液,滴加一抗CD133或CD166(用PBS缓冲液代替一抗为阴性对照),放置于4℃冰箱过夜处理；PBS液中冲洗5min×3次；使用吸水纸吸除残留载玻片上PBS缓冲液,滴加Super Enhancer液工作液,室温孵育15-20min；在PBS液中冲洗3min×3次；滴加Polymer HRP试剂,室温孵育30min：PBS液中冲洗3min×3次；甩去PBS液,每张片滴加2滴新配制的DAB溶液(按说明书配制)；3min后显微镜下观察显色情况,充分显色后终止反应,流动自来水充分冲洗15min；苏木素复染1min,酒精分化2秒钟,流动自来水中冲洗l0min以上,使用吹风机吹干；放入二甲苯透明,中性树胶封片。3统计学分析运用SPSS统计软件包进行数据分析。对所得数据进行统计学分析,实验数据用中位数(Median, M)表示。根据数据类型,性别、年龄、高低级别组脑膜瘤中CD133/CD166的IOD值比较采用两独立样本比较的Wilcoxon秩和检验,部位间采用多个样本比较的Kruskal-Wallis H检验。CD133与CD66的IOD值之间的相关性分析采用Spearman法。P<0.05表示差异具有统计学意义。四、结果1、CD133/CD166在脑膜瘤中的表达及分布形态多样,基本形态主要如下：CD133阳性细胞形态有点状阳性、簇状聚集阳性、血管周围存在阳性；CD166阳性细胞形态有散在点状阳性、簇状聚集阳性；两种抗体均表达于细胞膜及细胞质。2、CD133/CD166阳性表达在不同级别脑膜瘤组织的分布特征如下：CD133与CD166在不同级别的脑膜瘤均有表达；且CD133阳性细胞与CD166阳性细胞的分布有一定规律性,CD133及CD166阳性细胞表达水平随脑膜瘤病理分级增高而增高,低级别组CD133及CD166阳性细胞较少,多散在分布,高级别组CD133及CD166阳性细胞相对较多,更多标本中能够观察到阳性聚集分布,可见分布于血管壁的周围,在CD133染色中,可见CD133阳性血管,这些CD133阳性细胞考虑为血管内皮前体细胞,CD166染色为阴性。3、不同级别组脑膜瘤中CD133阳性细胞与CD166阳性细胞IOD值；在不同级别组脑膜瘤中CD133阳性细胞IOD值分别为2466.59(高级别组)及578.56(低级别组),秩和检验两组存在显著性差异(Z=—4.080,P=0.000)；在不同级别组脑膜瘤中CD166阳性细胞IOD值分别为12919.51(高级别组)及4678.79(低级别组),秩和检验两组存在显著性差异(Z=—4.657,P=0.000)。4、CD133与CD166表达的相关性及共定位表达情况,随CD133表达升高CD166表达也有逐渐增高的趋势。Spearman直线相关性检验显示CD133与CD166在脑膜瘤组织中IOD值呈显著正相关(R=0.706,P=0.000)。镜下观察连续切片组织,可发现在相同区域的两种抗体存在共定位表达的现象,周围组织呈阴性表达,可作为内对照区。5、CD133、CD166与脑膜瘤预后的关系,统计高低级别组脑膜瘤的3年内复发率,CD133弱表达组复发率为15.3896,强表达组复发率为28.57%,卡方检验二者无显著性差异(p=0.16),提示CD133的表达量与脑膜瘤复发无明显相关性。CD166弱表达组复发率为10.86%,强表达组复发率为32.35%,二者存在显著性差异(P=0.018)。CD166高表达组的复发率高于低表达组。五、结论1、CD133与CD166在不同级别的脑膜瘤均有表达,CD133及CD166阳性细胞表达水平随脑膜瘤病理级别增高而增高。并且在不同级别组脑膜瘤中CD133阳性细胞(p=0.001)与CD166阳性细胞(p=0.000)IOD值差异均有显著性。2、CD133及CD166表达成正相关关系。经Spearman直线相关分析表明,CD133阳性细胞与CD166阳性细胞IOD值呈显著正相关(p=0.000)。3、切片染色可观察到CD133与CD166共定位表达情况；CD166可能为脑肿瘤干细胞标记物之一,与目前公认的脑肿瘤干细胞标记物CD133可共同作为肿瘤干细胞的标记物。4、CD166高表达组复发率较高,CD166与脑膜瘤复发相关。