淋巴瘤(lymphoma)是来源淋巴造血系统的恶性肿瘤,在常见肿瘤中排名第七位,在所有肿瘤中占3-4%。它包括两大类:霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma,HL)以Reed-Stemberg细胞(R-S细胞)为特征;非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)包括B细胞和T细胞淋巴瘤。在美国霍奇金淋巴瘤的5年生存率是85%,非霍奇金淋巴瘤是69%,在中国,非霍奇金淋巴瘤以每年5%的速度增长,发病率从上世纪的2/10万上升为6.43/10万,而2012年全球有566 000新发病例,同时有305 000病人死亡。根据淋巴瘤的不同亚型,制定有效的治疗方案是刻不容缓的。随着对淋巴瘤生物学特征的不断研究,分子靶向药物的应用有效的提高了患者的5年生存率。因此,寻找新的肿瘤标志物,研究其在淋巴瘤中的机制有至关重要的意义。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸序列且不能翻译成蛋白的RNA,碱基组成从200bp到10万bp不等。研究发现它们具有高度的组织特异性,可通过转录调控、mRNA加工、海绵作用、入核转运等过程参与各种生理和病理过程。在肿瘤的发生发展过程中,它们作为肿瘤基因或者肿瘤抑制基因参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。LncRNA在肿瘤中的特异性表达和在肿瘤中的特殊生物学功能表明它们可以用来作为临床诊疗的分子标记和新的治疗靶点。超保守 RNA(Transcribed Ultraconserved Regions,T-UCRs)是 lncRNA 一种,碱基长度是200bp到799bp不等,在人、大鼠和小鼠中100%一致。超保守RNAuc.106和uc.102、uc.103、uc.104、uc.105位于编码基因OLA1的内含子中,uc.102更与第一外显子的部分序列重叠。文献报道在前列腺癌病人中,uc.106的表达水平与Gleason评分和前列腺癌的转移有相关性,并且敲低uc.106的表达后许多和细胞增殖、运动以及免疫相关的基因表达水平发生改变,说明uc.106在前列腺癌的发生发展中发挥作用。OLA1是Obg家族及p-loop GTP酶YchF亚家族中的一员,OLA1/YchF蛋白从细菌到人类进化过程中高度保守。有文献报道,OLA1可以调节细胞氧化应激及热休克反应,但与肿瘤的关系不明确。迷迭香酸甲酯(MethylrosmarinateMR)是一种从石见穿、紫苏、绒毛栗色鼠尾草等唇形科植物中分离出的天然活性成分。最近研究发现,迷迭香酸甲酯具有极强的抗氧化应激作用,但迷迭香酸甲酯在肿瘤中的功能及分子机制仍不清楚。本课题组首先利用临床收集的石蜡标本,在人弥漫大B细胞淋巴瘤石蜡组织和B细胞淋巴瘤细胞株中检测uc.106的表达情况,然后通过体内、外实验研究uc.106对B细胞淋巴瘤发生发展的影响,以及利用模拟人类Burkitt淋巴瘤模型,检测p53激活后uc.106的表达水平,研究uc.106发挥肿瘤抑制功能的分子机制。最后我们研究中草药单体迷迭香酸甲酯对淋巴瘤的干预作用,为淋巴瘤的治疗提供新的靶点和理论依据。第一部分uc.106在弥漫大B细胞淋巴瘤和小鼠B细胞淋巴瘤细胞株中的表达情况目的:检测弥漫大B细胞淋巴瘤石蜡组织和小鼠淋巴瘤细胞中的uc.102-106表达。方法:(1)收集20例扬州市江都区第一人民医院病理科确诊为弥漫大B细胞淋巴瘤患者的石蜡组织和20例正常淋巴结组织作为对照;(2)提取野生型BALB/c小鼠的骨髓B细胞和小鼠淋巴瘤细胞(38B9细胞和Myc3细胞)的RNA;(3)用特异性qRT-PCR实验方法检测弥漫大B细胞淋巴瘤石蜡组织和小鼠淋巴瘤细胞中的uc.102-106表达情况。结果:(1)与野生型BALB/c小鼠的骨髓B细胞相比较,uc.102、uc.104和uc.106在小鼠淋巴瘤细胞株38B9和myc3中表达降低,其中uc.106降低最明显。而uc.103和uc.105表达增高;(2)与对照组20例正常淋巴结组织相比较,uc.106在检测弥漫大B细胞淋巴瘤石蜡组织中表达降低;结论:uc.106在B细胞淋巴瘤中可能具有肿瘤抑制基因作用。第二部分uc.106在B细胞淋巴瘤中的作用及机制研究目的:研究uc.106对B细胞淋巴瘤细胞株38B9和Romas增殖的影响,并对其机制进行初步探讨。方法:(1)将uc.106克隆到MSCV-pig载体上,构建过表达uc.106质粒;(2)用逆转录病毒感染B细胞淋巴瘤细胞株38B9和Romas,过表达uc.106;(3)利用细胞计数、CCK-8实验和流式测GFP实验检测uc.106对B细胞淋巴瘤细胞株38B9和Romas增殖的影响;(4)流式细胞仪检测uc.106对B细胞淋巴瘤细胞株38B9和Romas周期的影响;(5)小鼠皮下荷瘤实验验证uc.106对小鼠成瘤快慢及大小的作用;(6)特异性qRT-PCR实验检测p53激活后uc.106表达水平的变化;(7)qRT-PCR实验检测p53激活后OLA1 mRNA水平的变化;(8)染色质免疫共沉淀实验(CHIP)验证p53和uc.106启动子区域的关系;(9)双荧光素报告实验验证p53和uc.106启动子区域的关系;(10)Western blot实验检测uc.106对OLA1蛋白水平的影响。结果:(1)过表达uc.106的逆转录病毒感染淋巴瘤细胞38B9和Romas后,uc.106的表达增高近900倍;(2)细胞计数、CCK-8和流式测GFP实验都证实uc.106抑制淋巴瘤细胞38B9和Romas增殖;(3)周期实验表明过表达uc.106后G0/G1期细胞数增多;(4)小鼠皮下荷瘤实验证实过表达uc.106的小鼠成瘤较晚,肿瘤的体积和重量较轻;(5)利用p53ER3小鼠淋巴瘤模型,腹腔注射他莫昔芬后激活p53,分不同的时间点(0 min、10 min、20 min、30 min 和 60 min)测得 uc.106 的表达升高,而 OLA1 的表达除了 20 min时略有降低其他时间点不变;(6)CHIP实验表明p53与uc.106上游2 000 bp启动子区域结合;(7)双荧光素酶报告实验证实p53与uc.106上游2000 bp区域有直接绑定关系;(8)在B细胞淋巴瘤细胞株38B9和Romas中过表达uc.106后,Western blot实验证实OLA1的蛋白表达水平增高。结论:uc.106无论体外或是体内都能抑制B细胞淋巴瘤细胞增殖,机制之一可能是p53的激活可以促进uc.106的转录,而过表达uc.106后提高了 OLA1的蛋白水平,形成OLA1/BRCA1/BARD1/p53复合体促进细胞凋亡。第三部分迷迭香酸甲酯对B细胞淋巴瘤的作用和机制目的:研究迷迭香酸甲酯对B细胞淋巴瘤细胞株38B9和Romas增殖的影响,并对其机制进行初步探讨。方法:(1)CCK-8细胞毒性实验检测迷迭香酸甲酯在B细胞淋巴瘤细胞株38B9和Romas中的半数抑制率IC50;(2)CCK-8细胞增殖实验检测迷迭香酸甲酯对B细胞淋巴瘤细胞株38B9和Romas增殖的影响:(3)不同浓度中药迷迭香酸甲酯(0、40、80和160 mol·L-1)处理38B9细胞和Romas细胞24 h后,定量PCR检测uc.106的表达;(4)流式细胞术检测迷迭香酸甲酯对B细胞淋巴瘤细胞株38B9和Romas凋亡和周期的影响;(5)Westernblot实验检测迷迭香酸甲酯对B细胞淋巴瘤细胞株38B9和Romas中自噬标记蛋白Bclin-1和LC3蛋白表达水平的影响。结果:(1)迷迭香酸甲酯对38B9细胞和Romas细胞24 h的半数抑制率IC50值分别为110.32μmol·L-1和 L-116.32 μmol·L-1;(2)迷迭香酸甲酯抑制38B9细胞和Romas细胞增殖,且具有浓度依赖性;(3)不同浓度中药迷迭香酸甲酯(0、40、80和160μmol·L-1)处理38B9细胞和Romas细胞24h后,uc.106的表达没有明显变化;(4)迷迭香酸甲酯能促进38B9细胞和Romas细胞早期凋亡,且具有浓度依赖性;周期实验显示迷迭香酸甲酯处理后G1期细胞显著增加;(5)不同浓度迷迭香酸甲酯处理38B9细胞和Romas细胞后,Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白水平呈浓度依赖性增加,并且LC3Ⅱ与LCⅠ比值明显升高。结论:迷迭香酸甲酯可能通过增加Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白表达诱导自噬,进而抑制38B9和Romas细胞的增殖,促进细胞的凋亡,发挥抑制淋巴瘤细胞的作用。