血吸虫病是流行于亚非拉发展中国家的严重危害人民健康、阻碍经济发展的重大传染病,仅在撒哈拉以南的非洲,每年因血吸虫病死亡的人数就超过20万(WHO,2012)。在我国,目前血吸虫主要流行于长江中下游江湖洲滩地区和四川云南两省山区。近年来,血吸虫病一直被我国政府列为重点控制的四大传染病之一(艾滋病、乙型肝炎、结核和血吸虫病)。吡喹酮自上世纪70年代被研发以来,已成为抗蠕虫药物的理想选择,由于安全高效、使用方便、不良反应少和价格低廉等特点,被WHO推荐为人体血吸虫病治疗的首选药物。自研发使用至今,全世界接受吡喹酮抗虫治疗的高危易感人群平均每年超过3000万。同一种药物现场大规模持续使用被认为会导致病原体抗药性的产生。曼氏血吸虫抗性株实验室的成功诱导,引起了全球血吸虫病防治研究者和WHO对曼氏血吸虫吡喹酮抗性的高度重视。在我国对日本血吸虫进行实验室药物选择同样诱导出了抗性株,使日本血吸虫吡喹酮抗性成为我国血吸虫控制必须重视的问题,对日本血吸虫吡喹酮抗性机制的研究已迫在眉睫。P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和多重抗性相关蛋白1(multidrug resistance–associated protein 1,MRP1)是最早被发现的两个ABC转运蛋白,其主要生理功能是依赖于ATP将氨基酸、糖类、脂类、无机离子、多糖、金属离子、多肽类以及有毒物质等各类生物分子经细胞膜进行主动转运。哺乳动物的肿瘤细胞可通过增加P-gp和MRP1等ABC转运蛋白的表达降低抗肿瘤药物在细胞内的积聚,从而达到抵抗药物杀伤的作用,即产生多重抗药性。已有研究证实曼氏血吸虫对抗虫药吡喹酮抗性的产生亦与P-gp和MRP1表达相关,认为这两种转运蛋白的表达上调可能参与了曼氏血吸虫的吡喹酮抗性机制。鉴于目前尚无P-gp和MRP1表达与日本血吸虫吡喹酮抗性的相关性进行过研究,本课题拟从基因水平通过采用分子生物学相关技术,去确定日本血吸虫的P-gp和MRP1基因是否存在,并且通过比较日本血吸虫抗性株和敏感株的P-gp和MRP1基因的表达差异,以及日本血吸虫在亚致死剂量吡喹酮刺激后这两个蛋白基因的表达变化,来探索日本血吸虫吡喹酮抗性与P-gp和MRP1表达相关性,为日本血吸虫吡喹酮抗性机制的深入研究提供基础。研究内容主要分为以下四个部分:第一部分日本血吸虫成虫P-gp和MRP1基因的扩增与鉴定目的:确定在日本血吸虫体内是否存在编码P-gp和MRP1基因。方法:通过查阅文献获得曼氏血吸虫P-gp基因SMDR2的编码区(CDS)和MRP1基因Sm MRP1的CDS,利用Genebank的核酸序列比对功能查找出相应的日本血吸虫P-gp基因的CDS;并且通过生物信息科学数据共享平台上的日本血吸虫数据库中,利用核酸序列比对功能查找出相应的疑似日本血吸虫MRP1基因的CDS。依据上述取得的日本血吸虫P-gp和MRP1基因序列,采用Primer Premier 6和Oligo7软件设计特异性引物。从日本血吸虫感染小鼠门静脉和肠系膜静脉收集成虫,提取成虫总RNA,并逆转录为c DNA,以设计的引物进行PCR扩增,并行2%琼脂糖凝胶电泳得到扩增条带。进行荧光定量PCR,绘制目的基因和内参基因的q PCR标准曲线,优化引物扩增效率,为后面的荧光定量PCR实验数据的处理提供依据。结果:通过BLAST功能和核酸序列比对软件找出了日本血吸虫P-gp和MRP1基因疑似同源序列,选择18S为内参基因,设计出包括内参基因在内的3对特异性引物,DNA琼脂糖凝胶电泳显示3个扩增产物大小均和预期大小一致。通过标准曲线计算的扩增效率分别为0.90,1.04和0.96,符合相对定量数据处理方法2-ΔΔCT法的要求。结论:日本血吸虫成虫体内存在编码P-gp和MRP1的相关基因。第二部分日本血吸虫成虫在吡喹酮刺激下P-gp和MRP1基因m RNA的表达变化目的:探讨日本血吸虫成虫P-gp和MRP1基因的表达水平变化与吡喹酮的相关性。方法与结果:体外实验方法:采用腹部贴片法感染小鼠,建立日本血吸虫湖南敏感株感染小鼠模型。小鼠感染尾蚴42天后断颈解剖,采用抗凝生理盐水灌注法收集成虫,并挑选没有损伤、活力良好的日本血吸虫成虫置于RPMI1640培养基中培养,向体外培养基实验组中加入亚致死剂量吡喹酮。置于37℃、5%CO2培养箱中培养。分别在加药后0.5h、4h和24h收集实验组和对照组成虫,提取各组成虫总RNA并逆转录为c DNA。分别以各实验组和对照组的c DNA为模板,进行实时荧光定量PCR实验检测P-gp和MRP1 m RNA表达水平。荧光定量PCR实验数据采用2-ΔΔCT法进行分析。体外实验结果:荧光定量数据分析显示:日本血吸虫敏感株成虫暴露于吡喹酮0.5h后,成虫P-gp表达量是对照组的2.81倍(P<0.05);暴露于吡喹酮4h后,成虫Pgp表达量与对照组相比略微有所升高,为1.54倍,但并无显著性差异(P>0.05);暴露于吡喹酮24h后,成虫P-gp表达量返回到基线水平,与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。即体外暴露于吡喹酮后,日本血吸虫成虫P-gp表达会出现一个短暂性的升高,之后又返回到基线水平。暴露于吡喹酮0.5h后,成虫MRP1表达量是对照组的2.14倍(P<0.05);暴露于吡喹酮4h后,成虫MRP1表达量与对照组相比仍旧有显著性升高,是对照组的2.69倍(P<0.05);暴露于吡喹酮24h后,成虫MRP1表达量反而低于对照组水平,为对照组的0.46倍(P<0.05)。体外暴露于吡喹酮后,日本血吸虫成虫MRP1表达会出现一个短时间内升高,随后又下降的趋势。体内实验方法:采用腹部贴片法感染,建立日本血吸虫湖南敏感株感染小鼠模型。将感染小鼠分为用药0.5h组、用药4h组、用药24h组和对照组,每组有3只感染小鼠。用药组于感染尾蚴后第40天一次灌胃给予75mg/kg剂量吡喹酮。分别在灌胃给药后0.5h、4h和24h将小鼠断颈解剖,采用抗凝生理盐水灌注法收集成虫,提取各组成虫总RNA并逆转录为c DNA。分别以各实验组和对照组的c DNA为模板,采用实时荧光定量PCR检测P-gp和MRP1 m RNA表达水平。荧光定量PCR实验数据采用2-ΔΔCT法进行分析。体内实验结果:荧光定量数据分析显示:日本血吸虫敏感株成虫暴露于吡喹酮0.5h后,成虫P-gp表达量是对照组的2.45倍(P<0.05);暴露于吡喹酮4h后,成虫Pgp表达量是对照组的2.50倍(P<0.05);暴露于吡喹酮24h后,成虫P-gp表达量返回到基线水平,与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。即体内暴露于吡喹酮后,日本血吸虫成虫P-gp表达会出现一个短暂性的升高,之后又会返回基线水平。暴露于吡喹酮0.5h后,成虫MRP1表达量是对照组的1.81倍(P<0.05);暴露于吡喹酮4h后,成虫MRP1表达量与对照组相比仍旧有显著性升高,是对照组的1.95倍(P<0.05);暴露于吡喹酮24h后,成虫MRP1表达量返回基线水平。即体内暴露于吡喹酮后,日本血吸虫成虫MRP1表达会出现一个短时间内升高,随后又下降至基线水平的趋势。结论:日本血吸虫成虫在暴露于亚致死剂量吡喹酮后,其体内P-gp和MRP1基因表达水平出现短暂性升高,提示日本血吸虫成虫体内P-gp和MRP1的表达与吡喹酮相关。第三部分日本血吸虫吡喹酮敏感株和抗性株P-gp和MRP1基因m RNA在不同发育阶段表达水平比较目的:探讨日本血吸虫吡喹酮敏感株与抗性株间P-gp和MRP1基因是否存在表达差异。方法:分别取日本血吸虫吡喹酮敏感株和抗性株感染钉螺,置于小烧杯中,加入脱氯水在光照下逸尾蚴,以逐级离心法(在50ml离心管6000r/min速度离心3分钟,沉淀转移至15ml离心管4000r/min速度离心5分钟,再转移至1.5ml离心管中10000r/min的速度离心3分钟)收集尾蚴。采用腹部贴片法感染,每只小鼠感染40条尾蚴,建立日本血吸虫抗性株感染小鼠模型和敏感株感染小鼠模型;尾蚴感染42天后解剖小鼠,采用门静脉灌注法收集成虫。取感染小鼠肝脏,剪碎并匀浆过滤,收集滤液,并于锥形瓶中进行沉淀获得虫卵;孵化毛蚴并收集入50ml离心管中,以逐级离心法(同尾蚴收集)收集毛蚴。将实验耗材进行无RNA酶处理后,分别提取日本血吸虫敏感株和抗性株的成虫、尾蚴和毛蚴的总RNA,逆转录为c DNA。分别以日本血吸虫敏感株和抗性株的成虫、尾蚴和毛蚴的c DNA为模板,以实时荧光定量PCR测定P-gp和MRP1 m RNA表达水平。荧光定量PCR实验数据采用2-ΔΔCT法进行分析。结果:荧光定量PCR熔解曲线显示3对扩增基因的熔解曲线均呈单一的波峰,曲线重合率均较好,熔解温度在80℃左右,认为选定的3对引物和荧光定量PCR条件参数能够特异性的扩增出内参基因片段和目的基因片段。荧光定量数据显示:日本血吸虫抗性株成虫、毛蚴、尾蚴P-gp基因m RNA的表达均高于敏感株相应各发育阶段虫体P-gp基因m RNA的表达。其中抗性株成虫P-gp的表达量是敏感株的2.21倍(P<0.05),抗性株毛蚴是敏感株的3.65倍(P<0.05),抗性株尾蚴是敏感株的2.83倍(P<0.05);日本血吸虫抗性株成虫、毛蚴、尾蚴MRP1基因m RNA的表达均高于敏感株相应各发育阶段虫体MRP1基因m RNA的表达。其中抗性株成虫MRP1的表达量是敏感株的5.68倍(P<0.05),抗性株毛蚴是敏感株的1.36倍(P<0.05),抗性株尾蚴是敏感株的1.50倍(P<0.05)。结论:日本血吸虫吡喹酮敏感株与抗性株间P-gp和MRP1基因表达存在差异,且抗性株成虫、毛蚴和尾蚴的P-gp和MRP1基因表达均高于敏感株相应的3个发育阶段,提示日本血吸虫成虫体内P-gp和MRP1的表达增高与吡喹酮抗药性相关。第四部分P-gp和MRP1抑制剂对日本血吸虫成虫排放虫卵的影响目的:探讨P-gp和MRP1抑制剂对日本血吸虫成虫排放虫卵的影响,从而间接了解P-gp和MRP1对日本血吸虫排放虫卵的相关性。方法:采用腹部贴片法感染小鼠,建立日本血吸虫湖南抗性株感染小鼠模型。小鼠感染尾蚴42天后断颈解剖,采用抗凝生理盐水灌注法收集成虫,并挑选没有损伤、活力良好的日本血吸虫成虫置于RPMI1640培养基中培养,向体外培养基实验组中加入不同浓度的Ppg抑制剂R(+)-Verapamil和MRP1抑制剂MK-571。置于37℃、5%CO2培养箱中培养48h,培养结束后在倒置显微镜下计数虫卵量。结果:当R(+)-Verapamil浓度为0.5μM时,对照组成虫平均排虫卵量是实验组的1.6倍;浓度为1μM时,对照组排虫卵量是实验组的2.3倍;浓度为2μM时,对照组排虫卵量是实验组的3.6倍。当MK-571浓度为5μM时,对照组成虫平均排虫卵量是实验组的1.6倍;浓度为25μM时,对照组排虫卵量是实验组的4.3倍;浓度为50μM时,对照组排虫卵量是实验组的4.7倍。结论:P-gp抑制剂和MRP1抑制剂均可导致日本血吸虫成虫排虫卵量的减少,并且排虫卵量与抑制剂浓度呈正相关,提示P-gp和MRP1这两种转运蛋白可能参与了日本血吸虫排放虫卵的生理过程。