目的：　　膀胱逼尿肌的特点是可发生自发性期相性收缩，其原因为L-型电压依赖的钙通道(VDCC)介导的钙离子内流以及细胞内钙库-肌浆网(SR)介导的钙释放。膀胱逼尿肌出现肌源性或者神经源性的活性改变都可以导致自发性期相性收缩的增加，引起逼尿肌不稳定(DO)的出现，引起相应临床症状。　　膀胱逼尿肌收缩与膀胱逼尿肌细胞的电兴奋活动密不可分，可以影响膜电位、跨膜电流、钙内流的因素都可以进一步影响膀胱逼尿肌的收缩活动。环磷酸腺苷(cAMP)信号通路的调节在膀胱逼尿肌收缩活动中起着重要的作用。在大多数细胞类型中，腺苷酸环化酶(ACs)将三磷酸腺苷(ATP)转化为cAMP，而磷酸二酯酶(PDE)水解cAMP为单磷酸腺苷(AMP)。在生理状态的细胞中，ACs和PDE达到一个动态的平衡，保证了cAMP稳定在一定水平。蛋白激酶A(PKA)是cAMP的效应器，是平滑肌细胞中一种十分重要的酶，它能调节SR中肌浆网ATP钙泵(SERCA)、Ryanodine受体(RyRs)和大电导电压及钙激活钾(BK)通道的活性。　　PDE可以作用于cAMP和环磷酸鸟苷(cGMP)，以前的研究发现cGMP对膀胱逼尿肌细胞的兴奋性并不起作用。此外，蛋白激酶G(PKG)对膀胱逼尿肌收缩性的调节作用也有争议。PDE4特异性作用于cAMP，由四个基因(PDE4A-PDE4D)编码了超过20个不同的剪接变异体。PDE4亚型有着器官和组织细胞类型的表达特异性，不同的PDE4亚型位于细胞内的不同位置。进行高选择性的PDE4亚型抑制，可以激活局部的cAMP/PKA通路，调节特异性的细胞功能。目前研究发现，在体内的24个不同组织中，PDE4D mRNA水平在膀胱有着高表达，也高于中枢神经系统和心肌。　　本研究从细胞和组织功能两个层面上阐述了PDE4可以通过作用于cAMP/PKA，调控SR上RyRs“钙火花”的释放，进而调节TBKCs，自发性瞬时超极化(STHs)和MP，降低细胞内Ca2+浓度，最终调节豚鼠膀胱逼尿肌细胞的兴奋性，同时控制豚鼠膀胱逼尿肌自发性期相性收缩、卡巴胆碱诱发的收缩及电场刺激(EFS)诱发的收缩，以及BK通道的调节。同时阐述了无cAMP激活的情况下，PKA的基础活性对于维持膀胱逼尿肌细胞兴奋性及膀胱逼尿肌收缩力的重要作用，以及BK通道在其中的作用。　　材料与方法:　　1、逼尿肌组织标本　　雄性豚鼠置入CO2密闭箱中15分钟，处死豚鼠。取出膀胱，置入0℃的解剖溶液(DS)中，保留膀胱顶至输尿管间嵴之间的膀胱组织，移除粘膜，将膀胱逼尿肌纵行切成2～3mm宽，5～7mm长的肌条。　　2、逼尿肌细胞新鲜分离　　将1～2枚逼尿肌离体肌条置入37℃2ml含有1mg/ml牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、1mg/ml papain和1mg/ml DL-dithiothreitol的2ml DS中12～18分钟，然后将肌条转移至37℃2ml含有1mg/ml BSA、0.5mg/mlⅡ型collagenase、0.5mg/ml trypsin抑制剂和100μM CaCl2的DS中12～15分钟最。然后将肌条用含有1mg/ml BSA的DS冲洗三遍后吹打肌条，得到新鲜分离的细胞悬液。　　3、逼尿肌离体肌条的cAMP测定　　根据cAMP酶免疫法的操作指南进行测定。将肌条放置在37℃PSS中进行孵育20分钟，给予95％O2，5％CO2，对不同的肌条分别给予10μM Rolipram（实验组）、10μM IBMX（阳性对照组）和生理盐水溶液（阴性对照组）。孵育后取出肌条置入液氮中，碾磨使其成为均质的粉末后加入到0～4℃的5％三氯酸中（每毫克组织加入10ml三氯酸），离心速度≥600g，离心时间10分钟后，提取上清液应用3倍体积的水饱和乙醚洗涤并干燥，之后进行测定。cAMP以每毫克组织中的含量(pM/mg)进行表述，应用ELX808Ultra Microplate Reader(BioTek，Winooski，VT)进行测定。　　4、共聚焦显微镜“钙火花”测定　　将新鲜分离的豚鼠膀胱逼尿肌细胞悬液置入底部给予poly-L-lysine的35mm圆皿中30分钟，使细胞附着在圆皿底部，移除上清后，给予含有2μM Fluo-4-AM的细胞外液，室温暗室孵育1小时后，应用细胞外液清洗3次，移除Fluo-4-AM。应用LSM700共聚焦显微镜63×油镜进行检测。488nm的氩激光作为激发光，发射光在510nm处记录。线性扫描的记录线设置为0.033μm/pixel，每一个循环扫描4s，速度为528lines/s，每隔1min重复扫描，共扫描10次。应用ImageJ SparkMaster插件进行分析。背景的荧光度F0为静息状态下的荧光度，认定“钙火花”的阈值设定为大于背景荧光度平均值3.8倍的标准差，“钙火花”的振幅和频率进行独立分析，取每组最后5次扫描的平均值。“钙火花”的频率单位为sparks/100μm×s。实验在室温下测定(22～23℃)。　　5、细胞内整体钙离子水平测定　　将新鲜分离的细胞悬液置入底部给予poly-L-lysine的35mm圆皿中30分钟，使细胞附着在圆皿底部，移除上清后，给予含有2μM Fura-2-AM的细胞外液，室温暗室孵育30分钟后，应用细胞外液清洗3次，移除Fura-2-AM。应用OLYMPUSIX81显微镜40×油镜和MetaFluor7.7.2.0进行检测。应用340nm和380nm波长处的光进行激发，曝光时间为15ms，曝光间隔为3秒，细胞内钙离子水平用510nm处的发射光强度的比值来表示，即F340/F380。所有试验在室温中进行(22～23℃)。　　结果:　　1、PDE4控制膀胱逼尿肌细胞的兴奋性。　　(1)PDE4对豚鼠膀胱逼尿肌cAMP水平的影响：应用酶免疫法检测可见选择性PDE4抑制剂Rolipram(10μM)将cAMP从对照组0.04±0.01pmol/mg升高到1.6±0.4pmol/mg(n=5，N=5;P＜0.05)，作为阳性对照组给予非选择性PDE抑制剂IBMX(10μM)，cAMP浓度升高到4.4±0.3pmol/mg(n=5，N=5;P＜0.05对比对照组;P＜0.05对比10μM Rolipram)。　　(2)PDE4对膀胱逼尿肌细胞内“钙火花”的调节：我们应用共聚焦显微镜进行快速线性扫描进行“钙火花”测定。对照组平均“钙火花”频率为38.2±12.1sparks/100μm×s(n=15，N=9)。选择性PDE4抑制剂Rolipram(10μM)明显提高豚鼠膀胱逼尿肌细胞“钙火花”频率至对照组的514±152％（n=15，N=9;P＜0.05），但“钙火花”振幅没有显著提升，为对照组的95.3±11.6％(n=15，N=9;P＞0.05)。　　2、PKA基础活性对膀胱逼尿肌细胞兴奋性和膀胱逼尿肌收缩力的影响。　　(1)PKA基础活性对豚鼠膀胱逼尿肌细胞静息状态下“钙火花”的影响：我们应用共聚焦显微镜进行快速的线性扫描进行“钙火花”测定。PKA抑制剂H-89(10μM)降低平均钙火花频率从对照组71.7±29.3sparks/100μm×s(n=8，N=6)至实验组的28.1±11.6sparks/100μm×s(n=8，N=6)，降低钙火花振幅从对照组1.4±0.5至实验组的1.0±0.3，即降低钙火花的频率和振幅至对照组的58.1±13.9％和79.7±7.8％(n=8,N=6;P＜0.05;)。　　(2)PKA基础活性对豚鼠膀胱逼尿肌细胞静息水平TBKCs的影响：PKA抑制剂H-89(10μM)完全抑制了豚鼠膀胱逼尿肌细胞TBKCs，在进行实验的所有细胞均可以观察到该作用(n=10，N=10)，随后给予PDE1抑制剂8MM-IBMX(10μM)不能提高TBKCs。另一种选择性的PKA抑制剂PKI14-22(5μM)完全抑制了逼尿肌细胞的TBKCs(n=6，N=5)。　　3、PDE4对豚鼠膀胱逼尿肌兴奋性和收缩性的影响及BK通道在其中的作用。　　PDE4对豚鼠膀胱逼尿肌细胞MP的影响及BK通道在其中的作用：选择性PED4抑制剂Rolipram(10μM)超极化豚鼠膀胱逼尿肌细胞MP平均8.6±2.9mV(n=8，N=6;P＜0.05对比对照组)，随后给予BK通道抑制剂Paxilline(1μM)重新去极化MP至对照组水平(-20.6±3.5mV;n=8，N=6;P＜0.05对比rolipram组)。应用paxilline(1μM)阻断了膀胱逼尿肌细胞STHs，去极化MP从-28.6±2.9至-18.2±2.1mV(n=7，N=5;P＜0.05对比对照组)。在paxilline（1μM）存在的情况下，给予rolipram(10μM)后MP为-18.1±2.7mV，并无明显改变(n=7，N=5;P＞0.05，rolipram对比paxilline)。　　结论：　　1、PDE4通过cAMP/PKA，调节膀胱逼尿肌细胞内SR上RyRs“钙火花”的释放，调节STOCs(TBKCs)，进而调节MP以及细胞内整体钙水平来调节细胞兴奋性。　　2、PKA(而非PKG)通过BK通道控制膀胱逼尿肌细胞兴奋性和收缩力。　　3、PDE4通过BK通道控制膀胱逼尿肌细胞兴奋性和收缩力。