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寡糖(Oligosaccharide or Oligosaccharides)是由2~10个单糖经糖苷键连接形成直链或支链的低聚合度糖类物质,又称低聚糖。它的分子量约为200~2000道尔顿。糖生物学研究表明,生物体内功能性糖蛋白上的寡糖在分子识别、蛋白折叠、信号转导等环节担任重要生理功能。外源性寡糖的研究表明,其具有抗血管生成、降血糖、抗肿瘤以及抗氧化等多种药理作用,是糖发挥生物学效应的重要活性片断。因此,为了获得高效、低毒寡糖片段,为先导化合物的发现打下基础,本论文主要围绕寡糖的制备、分离纯化、结构鉴定以及生物活性等方面进行了研究。本论文包括两个部分:一、对从夹竹桃花(NeHummdicum Mill)粗多糖酸水解所得的寡糖成分进行分离纯化、结构鉴定以及体外生物活性方面的研究;二、对从海带(Laminaria Japonica)中所得的寡糖成分进行分离纯化、结构鉴定以及体外抗肿瘤活性的研究。
第一部分内容包括:采用沸水提取6次,70%乙醇沉淀,透析除去小分子化合物,最后冷冻干燥得到夹竹桃花粗多糖。水提粗多糖经酸水解(100℃,0.2M三氟乙酸,水解4小时)得到粗寡糖。夹竹桃花粗寡糖经DEAESepharoseFastFlow柱层析水洗脱得到中性寡糖部位,再经活性炭柱以及Bio-GelP-2分子筛凝胶柱层析,最后分离得到五个纯寡糖,分别为NIOA-1、NIOA-2、NIOA-3、NIOA-4和NIOA-5。并且通过各种化学方法(糖组成分析,甲基化分析等)、光谱学方法(1HNMR,13CNMR,HMQC,GC-MS,ESI-MS等)对纯寡糖NIOA-1、NIOA-2、NIOA-3、NIOA-4和NIOA-5的一级结构进行了鉴定。分析结果表明:这五种糖都是由半乳糖以β1,4-连接组成的。其中NIOA-1、NIOA-2、NIOA-3、NIOA-4和NIOA-5分别为6、5、11、7、4个半乳糖组成的寡糖,而NIOA-3为一种全新的十一半乳低聚糖,其他几种寡糖均为首次从该植物中得到。
体外生物活性实验结果表明,NIOA-2和NIOA-3具有显著的抗血管生成活性,对HMEC—1细胞(Humarl Microvascular Endothelial Cell,人微血管内皮细胞)的生长和管腔形成有明显的抑制作用。这一结果为央竹桃花寡糖在抗肿瘤中的应用提供了重要依据。
第二部分内容包括:对海带寡糖成分的研究采用沸水提取5次,70%乙醇沉淀,上清液浓缩后冷冻干燥得到海带粗寡糖。而醇沉得到的沉淀经透析除去小分子化合物,最后冷冻干燥得到海带粗多糖。海带粗寡糖经活性炭柱以及Bio-GelP-2分子筛凝胶柱层析,最后分离得到三个纯寡糖LJ-Ⅲ-1、LJ-Ⅲ-2和LJ-Ⅲ-3,并通过各种化学方法(糖组成分析,甲基化分析等)、光谱学方法(1HNMR,13CNMR,HMQC,GC-MS,ESI-MS,IR等)对纯寡糖LJ-Ⅲ-1、LJ-Ⅲ-2和LJ-Ⅲ-3的一级结构进行了鉴定。分析结果表明:LJ-Ⅲ-1、LJ-Ⅲ-2和LJ-Ⅲ-3的主要结构特点是半乳糖与甘油分子1,1-连接组成的半乳糖苷。其结构分别为O-β-D-Galp-(1-1)-2,3-diacyl-D-glycerol(LJ-Ⅲ-1),O-α-D-Galp-(1-6)-β-D-Galp-(1-1)-2,3-diacyl-D-glycerol(LJ-Ⅲ-2)以及6-sulfo-α-Galp-(1-1)-2,3-diacyl-D-glycerol(LJ-Ⅲ-3)。其中LJ-Ⅲ-3为首次从该植物中得到。
体外生物活性实验结果表明,LJ-Ⅲ-1、LJ-Ⅲ-2和LJ-Ⅲ-3能够明显激活核转录因子NF-KB,从而可能调控机体内多种重要生物机能。例如炎症和免疫反应、发育、凋亡和抗凋亡。另一方面对LJ-Ⅲ-1、LJ-Ⅲ-2和LJ-Ⅲ-3的抑制肿瘤细胞增殖活性筛选试验结果表明,它们具有较为显著的抗肿瘤活性。这一结果为海带寡糖的应用提供了新依据。