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款冬花是一种常用中药,具有润肺下气、止咳化痰的功效,用于新久咳嗽、喘咳痰多、劳嗽咳血,对于慢性骨髓炎亦有一定疗效。款冬酮为款冬花升高血压的有效成分,黄酮醇苷为其止咳的有效成分。收载于各版《中国药典》,但是未收录其质量控制项。目前,几乎没有对款冬花质量的控制报道,已有的文献只是对其黄酮类成分槲皮素及芦丁的测定,不具有专属性,款冬花的质量标准体系不完善,亟需研究。 鉴于此,本课题从款冬花中标准物质的筛选、专属性有效成分款冬酮的分离鉴定、薄层鉴别、单成分及大类成分的含量测定和HPLC指纹图谱等几个方面对款冬花药材的质量控制进行了系统研究,建立了完善、可控的款冬花药材质量标准,并制定款冬花质量标准草案。 主要研究内容和方法如下: 首先,对款冬花进行了标准物质研究。根据中药质量标准对于中药材标准物质的要求,确定款冬花药材的标准物质为款冬花中倍半萜类成分款冬酮。款冬酮虽然是已知结构的化合物,但目前尚未有人将其作为中药标准物质进行研究。本课题对使用溶剂提取法款冬花中的款冬酮进行了提取,使用硅胶柱层析和高效液相半制备体系对其进行了分离和纯化,得到款冬酮晶体,并使用紫外及核磁光谱等方法对其结构进行了鉴定。 其次,使用分得的款冬酮纯品(纯度达98%以上),建立了款冬花中款冬酮的TLC鉴别方法:以石油醚∶乙酸乙酯(5∶1)为展开剂,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃下显色后在紫外灯(365nm)下检视,款冬花色谱中,在与款冬酮对照品及款冬花对照药材相应的位置上显相同的斑点。方法快速、稳定,可用于款冬花的鉴别。 再次,建立了款冬花中款冬酮的HPLC-UV含量测定法,以甲醇-水(77∶23)为流动相,流速1mL/min,检测波长:219nm,柱温:25℃;建立了款冬花中黄酮醇苷类成分槲皮素和山奈酚同时测定的HPLC-UV含量测定方法,以乙腈-0.1%H3PO4水溶液(33∶67)为流动相,流速1mL·min-1,检测波长:365nm,柱温:25℃。并均进行了方法学验证和系统适应性研究。结果表明,两套含量测定方法准确、快速、稳定、可靠。从单成分到大类成分对其化学成分进行含量测定,可以有效全面地控制款冬花的质量。同时,通过对多个产地和批次的款冬花药材中款冬酮和黄酮醇苷的测定,制定了款冬花中标准物质及有效成分的限量标准,为款冬花的质量控制提供可靠依据。 最后,按照国家药典委员会关于“中药指纹图谱研究的技术要求”和补充规定,并应用中国药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(版本:2004A)建立了款冬花药材的HPLC指纹图谱:以乙腈-0.1%H3PO4水溶液为流动相进行梯度洗脱;流速:1mL/min;检测波长为365nm;柱温25℃。得到12个共有峰,方法学考察表明,该法的稳定性、重现性均符合指纹图谱分析技术要求,用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件分析结果显示:13批款冬花药材相似度>0.8,说明各产地药材有比较好的一致性。试验证明,本方法可操作性强,重现性好,可作为款冬花黄酮醇苷类成分指纹图谱研究的基础。