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第一部分 RPA检测结核分枝杆菌Ag85B基因方法的构建及验证目的:结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）是引起结核病（tuberculosis,TB）的病原体,TB危害全球公众健康,是全球十大死亡原因之一的感染性疾病。TB疗程长,疗程中需要对疗效进行监测。因此,快速诊断和合理治疗是控制结核病流行的重要措施。传统痰检方法检测灵敏度低、核酸DNA检测并不能反映活菌。世界卫生组织（World Health Organization,WHO）推荐的Xpert MTB/RIF检测法所需检测设备/试剂昂贵。因此,开发一种准确、快捷、经济的替代方法,有望为临床提供多种选择,便于在基层医疗单位推广使用。重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）技术是一种体外等温核酸扩增新技术,具有快速、便捷、灵敏度特异度高的特点,可以在20分钟内检测出单个分子,且不需要复杂的设备和专业的操作人员,已经在医疗诊断、农业、食品、生物安全等多方面应用。既往研究认为,原核生物mRNA可作为检测活菌的标志,因此我们检测MTB特有的Ag85B基因的DNA和mRNA,可实现对MTB的检测及活菌进行实时监测,有助于判断MTB治疗疗效。基于以上的特点,本研究拟构建RPA技术检测MTB的方法并进行验证,为结核病的快速诊断及现场检测提供新的方法。方法:选择MTB特有的Ag85B基因作为检测靶基因,根据其Gene Bank基因序列,参照Twist Dx分析设计手册,针对保守区设计系列引物探针,并进行反应温度的优化和引物的优化,筛选出最佳的引物和反应条件。构建质粒标准品,倍比稀释不同浓度质粒作为反应模板,确定RPA方法的最低检测限,分析其灵敏度,并建立标准曲线和回归方程。选择MTB标准菌株（H37Rv）、卡介苗（bacille Calmette-Guérin,BCG）、非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria,NTM）、对照病原体抽提DNA,利用RPA方法进行检测,确立其检测方法的特异性。用RPA方法检测已知的20个MTB、20个NTM,验证其检测的可靠性。结果:1、根据检测靶基因的序列,设计4对探针引物,用三种不同浓度的质粒作为模板,筛选出最佳的引物为F4R4,最佳反应温度为39℃。2、构建质粒标准品并进行测序验证,计算其浓度为:4.0×1010copies/μL。3、RPA灵敏度检测提示最低检测限为4.0 copies/μL,建立了标准曲线,回归方程为:Y=14.22-3.33X,R~2=0.9420。4、RPA检测DNA样本中,MTB标准菌株H37Rv和BCG为阳性,其余2株NTM（堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌）和2株菌株（肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌）检测均为阴性,可见其特异度为100%。5、RPA检测20例MTB、20例NTM,结果显示20例MTB均有荧光信号,20例NTM均无荧光信号,可证实其检测方法的可靠性。结论:本文成功构建了实时荧光RPA检测MTB Ag85B基因的方法,操作简便,反应时间为20分钟,反应温度为39℃,其灵敏度高,最低可检测4拷贝分子,特异度为100%,重复检测结果可靠,为结核病的诊断提供了一种快速的核酸检测方法,可进一步实现现场检测。第二部分RPA快速检测结核分枝杆菌的初步临床应用目的:TB临床诊断困难,实际有超过30%的病例未被登记或者漏诊,不利于全球疫情的控制。RPA技术可用于MTB的快速核酸检测。第一部分已构建了RPA检测Ag85B的方法。本部分拟收集临床诊断的肺结核患者的痰标本,进行实时RPA检测,并与WHO推荐的Xpert MTB/RIF检测法进行比较,评价第一部分构建的检测方法用于结核病快速诊断的临床应用效果。方法:招募70例临床诊断为肺结核患者作为病例组,招募50例同期住院的其他呼吸道疾病患者作为对照组,收集所有研究对象的人口学资料和临床资料;收集患者清晨痰和即时痰,保存于有螺旋盖的无菌密封塑料盒,存储温度为4℃;处理痰标本,抽提纯化DNA和RNA,用RPA方法检测痰样本85B DNA,并与Xpert MTB/RIF结果进行比较。构建RT-RPA方法检测85BmRNA,随访肺结核患者,监测其治疗前后85BmRNA水平变化,并与痰涂片及85B DNA进行比较。结果:1、病例组70例,其中男性48（68.6%）人,女性22（31.4%）人,平均年龄（59.97±17.8）岁,职业以农民和退休人员为主,30（43%）人胸部CT可见空洞,25（35.7%）人有吸烟史,45（64.3%）人有慢性疾病史,如:高血压、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、支气管哮喘、肿瘤、脑梗塞、慢性肾脏病、慢性肝病、类风湿性关节炎、皮肌炎、精神病等,所有患者HIV检测均阴性;21（30%）例患者既往有肺结核或肺外结核病史,有2例患者家中有结核病患者。对照组50例,其中男性30（60%）人,女性20（40%）人,平均年龄（68.5±19.5）岁,COPD患者23（46%）例,肺炎患者16（32%）例,支气管扩张症6（12%）例,肿瘤患者5（10%）例。2、70例病例组中,RPA法检测痰标本85B DNA 63（90.0%）例为阳性,7（10.0%）例为阴性;对照组中痰标本1（2%）例为阳性,49（98%）例为阴性;Xpert MTB/RIF检测痰标本65（92.9%）为阳性,5例（7.10%）为阴性;50例对照组中Xpert MTB/RIF检测均为阴性。RPA方法的检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为:90%（80.0-96.0）、98%（89.0-100.0）,98%（92.0-100.0）、88%（76.0-95.0）;Xpert MTB/RIF检测值分别为93%（84.0-98.0）、100%（93.0-100.0）、100%（94.0-100.0）、91%（80.0-97.0）,Kappa值分别为0.865和0.915,结果显示两者的检测一致性均良好。3、构建RT-RPA方法检测85B mRNA,结果显示结核标准菌株H37Rv、BCG、两株结核痰标本有荧光扩增信号,堪萨斯分枝杆菌、胞内分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动菌均无荧光扩增信号,检测结果为阴性。4、随访观察26例病例,经过2HRZE/4HR方案抗结核治疗,在2周、4周、8周RPA-85B DNA、RT-RPA 85BmRNA、痰涂片阳性患者均有下降,其中RPA-85B DNA各时点阳性数最多;RT-RPA 85BmRNA与痰涂片相比,在2周时阳性率相当,0周、4周、8周痰涂片阳性率均低于RT-RPA 85BmRNA,三者比较,痰涂片灵敏度低,RT-RPA 85BmRNA更能反应活菌的情况,可以用于监测疗效。结论:前期构建的基于Ag85B靶基因的RT-RPA快速核酸检测方法应用于临床样本的检测,具有较高的灵敏度和特异度,与WHO推荐的Xpert MTB/RIF方法类似,明显优于传统的涂片方法。抗结核治疗中85BmRNA的水平更能反映活菌的数量,可用于结核患者治疗中的疗效监测,以助于临床医师及早发现耐药患者。