雷帕霉素（Rapamycin）作为雷帕霉素靶体蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制剂可以有效抑制mTOR通路活性并已经被广泛应用于临床，然而研究及临床数据发现，在多种肿瘤中雷帕霉素可通过负反馈途径激活PI3K/AKT或MAPK/ERK信号通路，从而导致肿瘤细胞对雷帕霉素的耐药性。然而对于PI3K/AKT或MAPK/ERK通路被雷帕霉素激活后，其下游的关键效应蛋白目前尚不清楚。通过预实验，我们发现人肺癌细胞经雷帕霉素处理后，Bad磷酸化水平提高，同时激活的ERK1/2和AKT水平升高，并且，在雷帕霉素抗性细胞株中Bad的磷酸化水平明显高于其敏感细胞株。因此，我们推测Bad磷酸化可能参与肺癌细胞对雷帕霉素的耐药性，并通过以下实验来证实这一观点：　　①初步证实雷帕霉素诱导的Bad磷酸化与肿瘤细胞对雷帕霉素耐药性之间的关系；　　②探讨雷帕霉素诱导的Bad磷酸化可能导致细胞耐药的相关机制；　　③证实雷帕霉素负反馈激活的Bad磷酸化激酶对Bad的调控作用，并探讨阻断该激酶是否可以提高或恢复细胞的敏感性；　　④体内实验探讨通过阻断Bad的上游激酶抑制Bad的磷酸化是否可以改善雷帕霉素对肿瘤的疗效。　　主要的研究结果如下：　　①通过免疫印迹实验发现，人非小细胞肺癌细胞株H460和H157经雷帕霉素处理后，BadS112/S136位点的磷酸化水平明显增高，同时发现ERK1/2和AKT作为雷帕霉素负反馈激活的信号通路和Bad的上游磷酸化激酶表达上调，表明Bad的磷酸化可能与肺癌细胞对雷帕霉素的耐药性相关。　　②通过SRB和平板克隆形成实验比较A549雷帕霉素敏感和抗性细胞株，确认其对于雷帕霉素的敏感性存在明显差异，然后比较其蛋白表达，发现抗性细胞株中的BadS112/S136位点和上游激酶ERK1/2、AKT的磷酸化水平明显高于敏感细胞株，进一步证实Bad磷酸化可能参与肺癌细胞对雷帕霉素的耐药性。　　③在H460、A549敏感和抗性细胞系中分别过表达Bad-WT或Bad-S112A/S136A(Bad-AA)，发现Bad-AA实验组（即Bad不能被诱导发生磷酸化），经雷帕霉素处理后，细胞的生长率与Vector对照组相比明显降低。同时发现过表达Bad-AA时，可以逆转抗性细胞对雷帕霉素的耐药性，表明Bad磷酸化在肺癌细胞对雷帕霉素的耐药性中发挥重要的作用。　　④首先通过免疫印迹和免疫细胞荧光实验证实雷帕霉素可以诱导Bad由线粒体转移至细胞质中，然后通过免疫共沉淀实验证实经雷帕霉素处理后，Bad与Bcl-XL的结合减少，与14-3-3蛋白的结合增加。同时发现雷帕霉素可以诱导浓度依赖性的Bad泛素化降解，从而缩短Bad的半衰期，使Bad的稳定性下降。该结果初步阐明了雷帕霉素可诱导Bad失活的分子机制。　　⑤通过免疫印迹和SRB实验证实阻断Bad的上游激酶可以有效阻断BadS112/S136位点的磷酸化，有效提高雷帕霉素对细胞的生长抑制作用，并可以逆转A549抗性细胞对雷帕霉素的耐药性。然后通过流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡，发现阻断ERK1/2和AKT激酶的活性，可以明显协同雷帕霉素阻断细胞周期的进程和诱导细胞的凋亡。进而明确了雷帕霉素负反馈激活的ERK1/2和AKT信号通路，通过诱导下游效应蛋白Bad的磷酸化而导致细胞的耐药性。　　⑥构建裸鼠荷瘤模型，体内实验证实用PD98059和AktshRNA阻断ERK1/2和AKT通路可以有效改善雷帕霉素的抑瘤作用，同时免疫组织化学染色检测不同处理组BadS112/S136/S155磷酸化位点的表达情况，最后用TUNEL法检测肿瘤组织中细胞的凋亡，进一步阐明阻断ERK1/2和AKT通路可以抑制Bad的磷酸化，从而有效改善雷帕霉素对肺癌的治疗效果。　　结论：　　通过本课题的研究证实，雷帕霉素可促进Bad由线粒体转移至细胞质中，减少Bad与Bcl-XL的结合，增加Bad与14-3-3蛋白的结合，从而失去其促凋亡活性。同时雷帕霉素诱导的Bad磷酸化促进其蛋白的泛素化降解，使Bad的半衰期明显缩短，从而降低Bad的稳定性。另外我们通过体内体外实验证实，通过阻断Bad的上游激酶ERK1/2和AKT来抑制Bad磷酸化可以提高肺癌对雷帕霉素的敏感性，并可以逆转抗性细胞的抗药性，从而有效改善雷帕霉素的治疗效果。我们的研究揭示了Bad在非小细胞肺癌细胞对雷帕霉素的耐药性中发挥重要的作用，初步阐明了雷帕霉素诱导Bad磷酸化从而导致肺癌细胞耐药的分子机制，明确了雷帕霉素通过负反馈激活ERK1/2和AKT从而诱导Bad的磷酸化的调控机制，为改善雷帕霉素的临床联合用药治疗提供新的靶点。