肝脏缺血再灌注损伤(LIRI)是一个级联炎症反应过程,发病机制复杂,涉及多种因素的参与及相互作用,包括：肝脏微血管紊舌L Kupffer细胞激活、活性氧簇(ROS)增多、炎性细胞因子[如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素18(IL-18)、白细胞介素6(IL-6)]及高迁移率组蛋白B1(HMGB1)等。炎症小体(inflammasome)是由多种蛋白组成的复合体,能激活炎性caspase复合物,caspase-1能被NALP3及NALP1炎症小体激活。活化的caspase-1能将proIL-1β和proIL-18分别剪切为IL-1β和IL-18,也有文献报道其能将proIL-33剪切为IL-33。NALP3炎症小体能识别许多内源性和外源性危险信号,包括细菌RNA、ATP、尿酸(urid acid, UA)、铝、石棉、硅石等。另外,胞浆内低浓度钾离子(钾离子外流)和ROS升高能激活NALP3炎症小体。近期研究表明,多种以发热、贫血及急性反应蛋白增高为特征的系统性炎症与IL-1β大量释放相关。缺血再灌注过程可释放多种激活炎症小体的启动因子,如钙聚集、钾离子外流、ROS及多种危险信号(如HMGB1、DNA及RNA)等,故推测炎症小体可能参与缺血再灌注损伤。文献已报道：炎症小体激活所释放IL-1β和IL-18在小鼠LIRI中是重要的启动因子,某些针对IL-1β和IL-18的治疗策略显示较好疗效；IL-1β在缺血再灌注损伤中发挥关键作用,IL-1β基因敲除小鼠能明显减缓缺血再灌注损伤；IL-1受体拮抗基因敲除小鼠缺血再灌注损伤明显加重。迄今,有关NALP3炎症小体是否参与肝脏缺血再灌注损伤,以及干预NALP3对小鼠肝脏缺血再灌注损伤的影响,均尚未见报道。本课题建立小鼠LIRI动物模型,并构建针对小鼠NALP3的干扰质粒,观察NALP3炎症小体参与LIRI的作用,并初步探讨其机制。结果发现：NALP3炎症小体在小鼠肝脏缺血再灌注所致无菌性炎症及组织损伤中起重要作用,其机制为：NALP3炎症小体参与IL-1β和IL-18等细胞因子成熟、释放；NALP3炎症小体参与肝脏细胞凋亡及炎性细胞浸润。本课题所获研究成果为临床上探索防治LIRI的策略提供了新的实验依据。一.NALP3炎症小体参与小鼠LIRI建立雄性C57/BL小鼠LIRI模型,同时设立假手术对照组。1.小鼠LIR后血清ALT/AST变化及肝脏形态学改变小鼠肝脏缺血1h再灌注6h后收集血清检测谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)变化,同时制作肝脏石蜡切片,H&E染色观察形态学改变。结果显示：模型组ALT/AST明显高于假手术组,形态学观察发现模型组出现大量肝细胞变性、凋亡、坏死及炎性细胞浸润。提示小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型制作成功。2.小鼠LIR后不同时间点IL-1β水平分别采集小鼠肝脏缺血1h再灌注1h、3h、6h及24h后血样,ELISA检测IL-1β水平。结果显示：与假手术对照组相比,血清IL-1β在1h后开始升高,6h达高峰,24h后回落至1h水平(p<0.05)。3.小鼠LIR后不同时间点NALP3蛋白表达小鼠肝脏缺血1h再灌注6h、12h及24h后分别取小鼠肝脏组织,免疫印记法检测NALP3蛋白水平。结果发现：与假手术组对照,小鼠缺血1h再灌注后NALP3蛋白开始上调,持续到12h,以6h最为明显(p<0.05)。4.小鼠肝脏缺血再灌注损伤后ROS变化小鼠肝脏缺血1h再灌注6h后分离非实质细胞(NPC), DCF染色,流式细胞术检测ROS含量。结果显示,与假手术对照组相比,缺血lh再灌注6h后ROS明显增高。以上结果提示,NALP3炎症小体参与小鼠LIRI过程。二、NALP3基因干扰载体的构建及鉴定1.针对小鼠NALP3基因干扰序列的筛选利用siRNA设计软件筛选针对小鼠NALP3基因的3条干扰序列及1条无关序列,分别合成并命名为siRNA1(S1), siRNA2(S2), siRNA3(S3)及scramble siRNA(SS),利用脂质体2000分别转染CHO细胞,Western-blot检测目的蛋白NALP3沉默效果,发现siRNA3沉默效果最佳,scramble siRNA无明显影响。故选择siRNA3序列为NALP3有效干扰序列。2.特异性pNALP3shRNA干扰载体的构建及鉴定分别将siRNA3特异性干扰序列及scramble siRNA无关序列构建入干扰载体pNALP3shRNA及pshRNANC中,经酶切鉴定及测序验证其正确性。利用小鼠巨噬细胞核转试剂盒分别转染pNALP3shRNA禾(?)pshRNANC至巨噬细胞,设立：nock组对照。荧光实时定量PCR检测NALP3 mRNA水平,Western blot检测其蛋白水平。结果发现,pNALP3shRNA干扰载体能特异性沉默NALP3基因(p<0.05),而对其他相关基因(NALP1b、NLRC4等)无影响。提示pNALP3shRNA干扰载体具有沉默特异性。3. pNALP3shRNA干扰载体对巨噬细胞分泌IL-1β的影响利用小鼠巨噬细胞核转试剂盒转染pNALP3shRNA和pshRNANC至巨噬细胞,设mock组对照。48h后继续给予LPS及ATP刺激,检测上清IL-11β含量。结果发现,转染pNALP3shRNA组IL-1β含量明显降低(p<0.05)。三、沉默NALP3基因对小鼠LIRI的影响及其机制1.体内干扰NALP3基因对小鼠LIRI的保护作用(1) pNALP3shRNA对小鼠肝脏的沉默效果尾静脉高压注射pNALP3shRNA质粒后48h,制作小鼠缺血1h再灌注6h动脉模型,实时定量PCR、Western blot、免疫组化及流式细胞术检测肝组织NALP3表达。结果表明：与生理盐水及pshRNANC组相比,pNALP3shRNA组NALP3表达明显下降；免疫组化显示NALP3主要表达于肝脏Kupffer细胞和肝窦内皮细胞。流式细胞术检测发现,Kupffer细胞和肝窦状内皮细胞NALP3表达均被抑制。(2) pNALP3shRNA预处理对小鼠缺血再灌注损伤后肝功能的影响小鼠肝脏缺血1h再灌注6h、12h及24h后收集血清及肝组织制作切片。检测ALT/AST水平及H&E染色。结果表明：与生理盐水及pshRNANC对照组相比,pNALP3shRNA组血清ALT/AST.水(?)平明显降低(p<0.01),H&E染色显示肝细胞变性坏死及炎性细胞浸润明显减少。提示pNALP3shRNA预处理小鼠能明显减轻肝脏缺血再灌注损伤。2.沉默NALP3基因对小鼠LIRI保护作用的可能机制(1) pNALP3shRNA预处理对小鼠LIRI后血清IL-1β、IL-18水平的影响小鼠缺血1h再灌注6h后,血清IL-1β和IL-18水平均升高；pNALP3shRNA预处理能明显降低血清IL-1β和IL-18水平(p<0.05),、Vestern blot检测发现pNALP3shRNA预处理能降低活化的Caspase-1水平。体外实验证实,pNALP3-shRNA能抑制巨噬细胞分泌IL-1β(p<0.05)。(2) pNALP3shRNA对小鼠血清细胞因子及HMGB1水平的影响与生理盐水及pshRNANC对照组相比,pNALP3shRNA预处理组小鼠缺血1h再灌注6h后血清TNF-α和IL-6水平明显减低,同时肝组织HMGB1表达明显降低(p<0.05)。再灌注后1h提取肝脏核蛋白,凝胶迁移率(EMSA)实验检测NF-κB的DNA结合活性,结果显示,pNALP3shRNA组NF-κB活性明显减低(p<0.05)。(3) pNALP3shRNA对小鼠肝细胞凋亡的影响小鼠缺血1h再灌注6h后,切取肝组织,4%多聚甲醛固定,制作石蜡切片,TUNEL法检测肝细胞凋亡。结果发现,与生理盐水组及pshRNANC组对比,pNALP3shRNA预处理能明显减轻小鼠缺血1h再灌注6h后肝细胞凋亡(p<0.05)。(4) pNALP3shRNA对小鼠肝脏巨噬细胞及中性粒细胞浸润的影响小鼠缺血1h再灌注6h后,切取肝组织,4%多聚甲醛固定,制作石蜡切片,免疫组化检测巨噬细胞(F4/80)和中性粒细胞(Gr-1)浸涧。结果发现, pNALP3sh-RNA预处理能明显降低巨噬细胞和中性粒细胞浸润(p<0.05)。四、结论1. NALP3炎症小体参与小鼠LIRI发生、发展。2. pNALP3shRNA预处理能保护小鼠肝脏缺血再灌注损伤。3.上述保护作用的可能机制为：抑制炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α,、IL-6及HMGB1释放；抑制NF-κB活性；减少肝细胞凋亡；减少炎性细胞浸润。