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高致病性猪繁殖与呼吸综合征（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,HP-PRRS）是一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸系统疾病为主要特征的高度传染性疾病,由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP-PRRS Virus,HP-PRRSV）引起。HP-PRRSV基因组变异速度快,传统防治手段效果不显著。本课题组前期研究结果表明通城猪对PRRSV的抗性比大白猪强,主要表现为病毒感染后通城猪组织病变程度较大白猪弱,血清病毒载量显著低于大白猪,IFN-γ显著高于大白猪。已有研究表明PRRSV感染后会诱导猪胸腺细胞凋亡、致使胸腺发生萎缩。作为重要的中枢免疫器官,胸腺萎缩会影响机体的免疫应答水平,削弱机体对病原体的抵抗能力。因而本研究以HP-PRRSV感染后通城猪和大白猪胸腺细胞为研究材料,通过探究两品种间胸腺细胞凋亡差异及调控该差异的关键基因的鉴定来阐述两品种间抗病力差异的机理,为抗病育种奠定基础。本研究在前期研究结果的基础上,以5周龄健康断奶仔猪通城猪和大白猪各6头为试验动物,按照同胞关系随机分为对照组和PRRSV感染组,感染后第7天采集胸腺,分离胸腺细胞检测细胞凋亡;并对细胞凋亡通路关键的调控基因进行筛选,发现TIM-3对于细胞凋亡的调控具有重要意义。结合本课题组前期Small RNA测序分析及预测发现miR-145-5p能靶向TIM-3 3′UTR,而研究显示miR-145-5p与细胞凋亡的调控密切相关,随后在PK-15CD163细胞中对miR-145-5p与TIM-3之间的调控关系进行研究,鉴定得到影响PRRSV诱导通城猪和大白猪细胞凋亡差异的关键基因。主要结果如下:1.发现通城猪和大白猪PRRSV感染后胸腺细胞凋亡存在差异通过采集PRRSV感染后两品种猪的胸腺细胞进行流式细胞凋亡检测、q RT-PCR及Western Blot检测细胞凋亡通路相关基因,发现PRRSV感染后大白猪胸腺细胞早期细胞凋亡率、晚期细胞凋亡率升高的倍数均高于通城猪,尤其是大白猪的晚期凋亡率呈现显著升高的趋势;q RT-PCR、Western Blot结果表明:促凋亡基因BAD、BAK1、BAX、BID在大白猪中均上调表达约1.5倍以上,而在通城猪中下调表达约1.5倍以上;抗凋亡基因BCL2、BCL2L1在大白猪中显著下调表达而在通城猪中无明显变化;细胞凋亡标志物CASP3、CASP9、CASP8在大白猪中显著上调表达约1.7倍以上,在通城猪中没有明显变化。以上结果表明PRRSV感染后通城猪和大白猪的细胞凋亡存在差异,通城猪的细胞凋亡程度比大白猪轻。2.发现TIM-3是影响细胞凋亡差异的关键基因对PRRSV感染后两品种猪胸腺细胞TIM-3的表达量进行定量检测,发现TIM-3在大白猪中显著上调表达约5.7倍,在通城猪中无明显变化。通过构建TIM-3的CDS载体并在PK-15CD163细胞中超表达TIM-3后检测细胞凋亡标志物CASP3,发现超表达TIM-3后细胞凋亡标志物CASP3表达量显著升高约3倍;在PK-15细胞中转染TIM-3的CDS载体并通过流式细胞凋亡检测,发现超表达TIM-3后早期细胞凋亡率与对照组相比显著上调表达约2.8倍,而晚期细胞凋亡率则上调约2.5倍,上述实验结果表明TIM-3能显著的促进细胞凋亡。3.发现TIM-3受miR-145-5p调控并且miR-145-5p能影响细胞凋亡对PRRSV感染后两品种猪的胸腺细胞中miR-145-5p表达量进行检测发现,miR-145-5p在大白猪感染后无明显变化,在通城猪中极显著上调表达约2.4倍。（1）通过对TIM-3与miR-145-5p进行序列比对分析预测,发现TIM-3 3′UTR区域存在两个与miR-145-5p种子序列相结合的位点,分别构建野生型和突变型TIM-3 3′UTR载体、野生型和突变型miR-145-5p前体载体,合成野生型和突变型miR-145-5p mimics。首先在PK-15CD163细胞中共转染（野生型和突变型）miR-145-5p mimics和（野生型和突变型）TIM-3 3′UTR,然后进行双荧光素酶报告基因实验。结果表明:野生型miR-145-5p mimics能显著靶向TIM-3 3′UTR野生型和两个单突变型,并且对TIM-3两个单突变位点的靶向效率没有显著差异;而突变型miR-145-5p mimics与TIM-3 3′UTR双突变型进行的靶向关系回复实验中,发现突变型miR-145-5p mimics只能显著靶向TIM-3 3′UTR双突变型。随后,又在PK-15CD163细胞中共转染（野生型和突变型）miR-145-5p前体和（野生型和突变型）TIM-3 3′UTR,然后进行双荧光素酶报告基因实验。结果表明:野生型miR-145-5p前体能显著靶向TIM-3 3′UTR野生型和两个单突变型,并且对TIM-3两个单突变位点的靶向效率没有显著差异;而突变型miR-145-5p前体与TIM-33′UTR双突变型进行的靶向关系回复实验中,发现突变型miR-145-5p前体只能显著靶向TIM-3 3′UTR双突变型。上述实验结果表明TIM-3与miR-145-5p存在靶向关系,并且miR-145-5p对TIM-3 3′UTR两个单突变位点的靶向效率无显著差异。同时,在PK-15CD163细胞中超表达野生型和突变型miR-145-5p前体、野生型和突变型miR-145-5p mimics,并通过Western Blot对细胞内源TIM-3蛋白表达量的变化进行检测。发现转染野生型miR-145-5p前体和野生型miR-145-5p mimics后,细胞内源TIM-3的表达量下降;而转染突变型miR-145-5p前体和突变型miR-145-5p mimics后,TIM-3的表达量无显著变化。表明miR-145-5p能抑制内源TIM-3蛋白的表达。（2）在PK-15CD163细胞中超表达野生型和突变型miR-145-5p mimics,通过Western Blot检测细胞凋亡标志物CASP3的表达量变化。结果发现超表达野生型miR-145-5p mimics后,CASP3表达量显著下降;而超表达突变型miR-145-5p mimics后,CASP3表达量无显著变化。同时,本研究还对PK-15CD163细胞中野生型和突变型miR-145-5p前体超表达后细胞凋亡标志物CASP3的表达量进行了进一步的检测,结果发现超表达野生型miR-145-5p前体后,CASP3表达量显著下降;而超表达突变型miR-145-5p前体后,CASP3表达量无显著变化。上述实验结果表明,miR-145-5p能通过下调抑制CASP3的表达来抑制细胞凋亡。综上所述,通城猪和大白猪细胞凋亡的差异受到TIM-3的调控,PRRSV感染后通城猪的细胞凋亡程度弱于大白猪,并且在大白猪中TIM-3的表达量显著升高而在通城猪中无明显变化;同时TIM-3通过其3′UTR区域与miR-145-5p的靶向关系受到miR-145-5p调控,从而实现miR-145-5p对细胞凋亡的调控,PRRSV感染后通城猪miR-145-5p表达量显著上升而大白猪无明显变化。TIM-3通过调控两品种间的细胞凋亡差异并受到miR-145-5p的调控,能调节机体细胞免疫应答水平,进而影响通城猪和大白猪对PRRSV感染的抗性差异。