【摘 要】
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牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、赤羽病均能造成妊娠牛的繁殖障碍,产出死胎、畸形胎,给养牛业造成了巨大损失。由于这三种病常呈隐形感染或混合感染,且症状相似,很难依据临床症状进行鉴别诊断,随着分子生物学的发展,特别是荧光定量PCR检测技术的快速普及,相继有学者建立了荧光定量PCR检测方法,但牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、阿卡斑病毒的多重荧光PCR检测方法少见报道。因此,建立牛病毒性腹泻病毒、
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牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、赤羽病均能造成妊娠牛的繁殖障碍,产出死胎、畸形胎,给养牛业造成了巨大损失。由于这三种病常呈隐形感染或混合感染,且症状相似,很难依据临床症状进行鉴别诊断,随着分子生物学的发展,特别是荧光定量PCR检测技术的快速普及,相继有学者建立了荧光定量PCR检测方法,但牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、阿卡斑病毒的多重荧光PCR检测方法少见报道。因此,建立牛病毒性腹泻病毒、阿卡斑病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的多重荧光PCR检测方法开展快速高效的实验室鉴别诊断,对牛病的防治具有重要的意义。本研究根据牛病毒性腹泻病毒、阿卡斑病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的保守基因序列,应用Geneious Prime软件经多重比对,设计了多重荧光PCR特异性引物和探针,经反应条件优化,确定了了最佳退火温度和引物探针浓度。将经数字PCR标定的BVDV、AKAV、IBRV核酸分别10倍稀释共10个浓度梯度,应用本方法进行灵敏性试验和重复性验证,结果显示牛病毒性腹泻病毒最低检出限为3.5 copies/μL,牛传染性鼻气管炎病毒的最低检出限为5.2 copies/μL、阿卡斑病毒的最低检出限为6.7 copies/μL,每组数据组间变异系数均在5.0%以下。分别采用副结核杆菌、沙门氏菌、呼吸道合胞体病毒、轮状病毒和冠状病毒进行特异性验证,结果证实本方法不会与其他牛常见病原体产生交叉反应。应用本方法对吉林省2017-2019年9个地区（蛟河市、公主岭市、梅河口市、榆树市、敦化市、柳河县、农安县、通榆县、梨树县）的肉牛养殖场、奶牛养殖场、屠宰企业、散养户采集的1800份牛全血样品进行检测,结果显示BVDV的检出率为1.83%（33/1800）、IBRV的检出率为6.5%（117/1800）、AKAV的检出率为0%。对近期采集的具有流产和畸形胎临床症状的252份牛全血样品进行检测,结果显示BVDV的检出率为1.19%（3/252）、IBRV的检出率为0.4%（1/252）、AKAV的检出率为68.25%（172/252）。综上所述,本研究成功建立的BVDV、IBRV与AKAV多重荧光定量PCR检测方法具有较高灵敏性和特异性,且稳定性较强,可广泛应用于BVDV、IBRV与AKAV的实验室鉴别诊断,为牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎、赤羽病的防治提供了技术支撑。
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