一、研究背景肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一。小细胞肺癌(SCLC)占所有肺癌的15%左右。它的特点是快速增长,早期扩散和和对一线化疗或放疗显著敏感。然而,由于治疗过程中放化疗的耐受,目前三分之二的患者具有高复发率,随后的预后较差。虽然一些分子如Bmi1、MDR1/ABCB1等与放化疗相关,但它们不能有效地应用于临床。因此,小细胞肺癌的治疗仍然具有挑战性,靶向与耐受相关的更有效的治疗的研究是必要的。细胞表面糖蛋白的异常糖基化与很多人类肿瘤高度相关。位于高尔基体内的葡萄糖基转移酶在糖蛋白的合成中起关键作用。N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶(N-acetylglucosaminyltransferases, GnTs)至少有6种,分别是GnT-Ⅰ、GnT-Ⅱ、 GnT-Ⅲ、GnT-Ⅳ、GnT-Ⅴ和GnT-Ⅵ。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V(N-acetylglucosaminyltransferase V, GnT-V)是目前研究最多的,是多支N链糖蛋白合成过程的关键酶。研究显示,GnT-V催化在N-聚糖的β1,6乙酰葡萄糖酰胺分支,通过促进细胞增殖,抑制细胞凋亡等与细胞的恶性转化相关。在一些研究中,探索了治疗耐受性和N-聚糖之间的关系。例如,用衣霉素抑制N链糖蛋白合成提高了人头颈部肿瘤细胞对顺铂的敏感性。人类胶质母细胞瘤细胞株表面蛋白糖基化的改变可降低耐药。我们的实验室曾报道下调GnT-V后人鼻咽癌CNE-2细胞在体外和体内的放射敏感性增强。然而,GnT-V在多药耐药的(multidrug resistant, MDR)小细胞肺癌细胞中的放射耐受的作用还不清楚。为了进一步研究GnT-V在MDR小细胞肺癌中放射耐受的作用,建立了低表达GnT-V的SCLC亚系细胞(H69AR GnT-V/1564和H69AR GnT-V/2224)。研究表明下调GnT-V显著提高了小细胞肺癌细胞对药物和放射的敏感性。此外,NF-кB和凋亡相关分子参与了GnT-V调控放射抵抗性。这些结果表明,GnT-V可能是小细胞肺癌放化疗抵抗性的一个潜在的靶点。二、研究目的1.本实验选择人小细胞肺癌细胞株H446、H69与其多药耐药细胞株H69AR作为研究对象,分析细胞对放化疗敏感性的差异。2.分析小细胞肺癌细胞株H69AR、H69与H446在蛋白水平GnT-V表达的差异,研究GnT-V是否参与多药耐药小细胞肺癌细胞株的放射耐受。3.运用shRNA将高表达GnT-V的H69AR细胞株中的GnT-V进行沉默后,检测沉默效果,观察H69AR细胞株放化疗敏感性的变化。4.阐明在多药耐药小细胞肺癌H69AR细胞的放射耐受中GnT-V的作用和其潜在的机制。三、实验方法3.1细胞系和细胞培养人的小肺癌细胞株NCI-H446, NCI-H69和耐药亚系NCI-H69AR均购自美国ATCC细胞库。H69细胞悬浮聚集生长,传代通过轻轻机械吹打均匀按适当比例稀释后分装至新培养瓶中；而H69AR或H446单层贴壁生长,需要使用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化传代。所有细胞均常规培养在含胎牛血清(FBS)(H69AR培养基含20%胎牛血清；H69和H446细胞株培养基含10%胎牛血清)和谷氨酰胺的RPMI1640培养基中,置于37℃5%C02的孵箱中培养。高表达MRP1/ABCC1的H69AR用不含和含0.8μM阿霉素(ADM)的培养基交替培养。用药物定期检查耐药株H69AR的耐药性。每周监测所有细胞的形态和生长状态。3.2CCK-8法检测药物和放射敏感性通过细胞计数试剂盒(CCK-8)测定化疗或放疗引起的效应。抗癌药物阿霉素(ADM,中国深圳),顺铂(DDP,中国山东)和依托泊苷(VP-16,中国江苏)根据说明书溶解,用5个浓度测试。药物的浓度范围基于以前的研究,旨在获得高度敏感和耐药细胞的IC50值(导致50%生长抑制的药物浓度)。通过直线加速器(Clinac2300C/D,美国)给予6mV X射线放射细胞。用CCK-8水溶性四唑盐-WST(?)-8[2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐]定量抗癌药物或放射诱导的细胞死亡。根据各个药物浓度或不同照射剂量下细胞存活率,作存活曲线,得到药物ICso值和放射敏感性曲线。细胞存活率=(处理组平均OD值-空白组平均OD值)／(非处理组阳性对照组平均OD值-空白组平均OD值)×100%。本试验按照下述步骤进行。消化细胞,重悬,调整细胞浓度为1×105/ml,按100μL/孔接种于96孔板中(104/孔),设空白对照孔。铺板后放入37℃5%CO2培养箱中培养。培养24h后,将化疗药物ADM、DDP、VP-16加入培养基中并进行倍比稀释,按不同浓度分别加入指定的孔中,并设不加药物的阳性对照孔。或以OGy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy放射细胞。细胞继续培养24h后,加入CCK-8反应液,在37℃,5%CO2环境下培养2h后在酶标仪上测450nm吸光度。测得的每个药物浓度或放射剂量的OD值。进行3次独立平行实验,每次实验含3个复孔。3.3pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA的构建和转染pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA从上海吉玛公司获得。按以前的文献分别构建了pGPU6/GFP/Neo GnT-V/1564(反义GnT-V基因质粒),pGPU6/GFP/Neo GnT-V/2224(反义GnT-V基因质粒),pGPU6/GFP/Neo GnT-V/NC(对照质粒);构建和鉴定低表达GnT-V的小细胞肺癌亚株(H69AR GnT-V/1564和H69ARGnT-V/2224)和对照的转染细胞株(H69AR GnT-V/NC),具体方法参见文献。3.4裸鼠皮下成瘤及分次放射实验BALB/C nu/nu裸鼠均为雄性,4-6周龄,由广东省医学实验动物中心提供,并饲养于中山大学SPF级试验室。动物实验按照中山大学伦理委员会的规定执行。选择H69AR、H69、H446和H69AR GnT-V/NC、H69AR GnT-V/1564、H69AR GnT-V/2224组细胞扩大培养,用于皮下注射。用PBS重悬细胞,调整其浓度为5×107个/ml,每组接种200μl癌细胞悬液于左臀部皮下。注射后用卡尺定期测量瘤体的短径和长径,瘤体体积=(短径2×长径)／2；裸鼠移植瘤生长14天(肿瘤体积大约300mm3)后进行下一步的实验。分次放射按以前文献所述的进行,标化瘤体体积=放射第X瘤体体积／同组中放射第0瘤体体积。12天后(总剂量10Gy的照射完成2天后),断颈处死裸鼠,剥离瘤体,固定,石蜡包埋切片,进行HE染色检测；Western Blot法检测组织中Bcl-2、Bcl-xl和Bax蛋白表达水平变化。3.5细胞周期检测为了分析细胞周期分布,X线放射(OGy、6Gy)后24小时收集细胞,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次,然后用70%冷乙醇固定12小时。PBS重悬细胞,调整细胞浓度至106/ml。用PBS洗涤后,将细胞用含核糖核酸酶的PBS处理。接下来,DNA用碘化丙啶(PI)冰上染色30分钟,通过流式细胞仪分析细胞周期(BD Biosciences,英国)。实验重复3次。3.6细胞凋亡检测Hoechst33258-染色观察凋亡形态,细胞接种在24孔板生长至单层,0Gy、6Gy放射后继续培养24小时,吸尽培养液,用冷PBS洗两遍,加入0.5ml的4%甲醛固定液,4℃固定10分钟,去固定液,用PBS洗两遍,吸尽液体,加入0.5ml Hoechst33258染色液,室温避光染色10分钟,去染色液,用PBS洗三遍,吸尽液体。荧光显微镜下观察和拍摄细胞凋亡形态。OGy、6Gy放射细胞后继续培养24小时。按照细胞凋亡检测试剂盒说明书用流式细胞仪检测和分析细胞凋亡率。0Gy、6Gy放射细胞后继续培养24小时。采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)原位细胞凋亡检测试剂盒,按试剂盒说明进行TUNEL实验,检测细胞凋亡时的特征性DNA链断裂。荧光显微镜下观察,随机选5个视野计数处理或转染细胞中TUNEL阳性的细胞。利用特异底物通过比色法检测Caspase-3的活性。待细胞贴壁后接受X线(0Gy、6Gy)放射后24小时。胰酶消化离心收集待测细胞,重悬细胞,冷PBS洗一次。加入细胞裂解液重悬细胞,冰上孵育10分钟。裂解液16,000转离心10分钟,取上清于检测缓冲液中测定Caspase-3活性；加入Caspase-3底物Ac-DEVD-pNA37℃孵育1小时。然后用分光光度计测定在405nm的吸光值。通过比较放射组和相应的对照组的吸光值来检测Caspase-3活性的增加。3.7双萤光素酶报告基因检测NF-кB活性为确定放射或GnT-V抑制在放射诱导的NF-кB转录活性,细胞接种到24孔板24小时后长满70-80%。参照Lipofectamine2000(Invitrogen,美国)说明书,共转染pNF-кB-Luc和pRL-CMV(由澳大利亚墨尔本彼得·麦卡勒姆癌症中心的转移研究实验室馈赠)到待测细胞中。转染24小时后,0Gy、6Gy放射细胞后继续培养24小时,收集细胞,裂解后检测荧光素酶的活性确定NF-кB转录活性。荧光素酶活性检测使用的试剂盒为Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega,美国)。Berthold Lumat LB9507化学发光检测仪检测萤光素酶活性。3.8细胞免疫荧光OGy、6Gy放射细胞后继续培养24小时。NF-кB p65、Cy3标记的二抗染色待测细胞,DAPI染核。通过莱卡DMIRE2荧光显微镜(Leica,德国)观察和拍照染色细胞。分别拍摄Cy3标记染色的NF-кB p65和DAPI染核的图片,再将两张图片重叠组合。3.9Western Blot分析X线(OGy,6Gy)放射细胞后继续培养24小时,收集细胞(107)。加入蛋白裂解液提取蛋白,用标准的BCA方法(BCATM蛋白检测试剂盒,美国)测定蛋白浓度。取蛋白样品和上样缓冲液,离心混合后煮沸5min,离心后吸取依次上样,同一实验不同上样孔之间蛋白含量相等(20μg/孔)。10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白,并半干电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5%脱脂奶粉37℃封闭PVDF膜2小时。一抗(Bcl-2、Bax一抗稀释浓度为1：200,Bcl-xl稀释浓度为1：300,均购自美国Santa Cruz公司；GAPDH蛋白单克隆抗体稀释浓度1：1000,购自中国Abmart公司)与PVDF膜4℃孵育12小时,TBST (10mM Tris,pH值8.0,150mM NaCl和0.1%吐温20)洗膜。通过与辣根过氧化物酶标记的二抗(抗体稀释浓度1：4000,购自北京博奥森生物科技有限公司)室温孵育45分钟,再次洗涤。增强化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)显影,在PVDF膜上面覆盖X-线胶片,根据发光情况曝光数秒至数分钟,冲洗胶片。Quantity One软件分析条带强度。3.10统计学分析至少三次独立重复实验的结果用均数±标准差来表示。两个样本之间均数的比较用Student’s t检验,多组进行统计比较使用单向方差分析(ANOVA),多重比较用最小显著差异法(LSD)。结果分析P<0.05代表有统计学差异,实验结果均由SPSS13.0软件统计。四、实验结果4.1小细胞肺癌细胞株的药物和放射敏感性为了确定小细胞肺癌细胞对化疗药物的敏感性,CCK-8法评价了细胞对阿霉素,顺铂和依托泊苷的IC50值。与H69、H446细胞相比,H69AR细胞对药物的IC50值显著增加(P<0.05)。说明耐药株H69AR细胞对多种药物耐受。CCK-8法研究小细胞肺癌细胞的放射敏感性。4个剂量(分别2,4,6和8Gy)放射细胞。与H69AR细胞相比,H69或H446细胞在任何放射剂量时的存活率显著降低(P<0.05)。结果表明耐药株H69AR细胞对放射抵抗。4.2比较小细胞肺癌细胞中GnT-V的表达qRT-PCR法和Western Blot法评估了H69AR、H69细胞和H446细胞中GnT-V的mRNA和蛋白表达水平。结果显示与H69或H446细胞相比,H69AR细胞中GnT-V的mRNA和蛋白表达量显著升高(P<0.05)。H69AR细胞高表达GnT-V和对放化疗抵抗,这表明GnT-V可能参与小细胞肺癌的放化疗抵抗。4.3通过GnT-V shRNA建立低表达GnT-V的H69AR为了进一步研究GnT-V在H69AR细胞中放射抵抗性的作用,建立了低表达GnT-V的H69AR细胞。pGPU6/GFP/Neo GnT-V/N, pGPU6/GFP/Neo GnT-V/1564和pGPU6/GFP/Neo GnT-V/2224转染入H69AR细胞。G418筛选1个月得到转染的细胞(H69AR GnT-V/NC, H69AR GnT-V/1564和H69AR GnT-V/2224)。荧光显微镜显示,转染细胞发出绿色荧光。在H69AR和H69AR GnT-V/NC细胞中,GnT-V的mRNA和蛋白的表达均无显著性差异。qRT-PCR的结果显示,与H69AR GnT-V/NC相比,干扰GnT-V表达的H69AR GnT-V/1564和H69AR GnT-V/2224细胞株GnT-V的mRNA表达被抑制,表达分别降低了(62.00±4.35)%和(73.12±3.52)%。Western Blot法检测显示,与H69AR GnT-V/NC相比,H69AR GnT-V/1564和H69AR GnT-V/2224细胞的GnT-V的蛋白表达均被抑制,表达量分别降低了(68.24±3.53)%和(76.52±4.67)%。在mRNA和蛋白水平都已证实,与H69AR GnT-V/NC相比,H69AR GnT-V/1564和H69AR GnT-V/2224细胞的GnT-V表达均降低。4.4抑制GnT-V使H69AR细胞对化疗药和放射敏感CCK-8法检测转染后的H69AR对化疗药物的存活。与H69AR GnT-V/NC相比,H69AR GnT-V/1564或H69AR GnT-V/2224细胞对化疗药物的生长抑制的IC50值更小(P<0.05)。结果表明,下调GnT-V使SCLC细胞对化疗药物敏感。CCK-8法检测H69AR GnT-V/NC、H69AR GnT-V/1564和H69AR GnT-V/2224的细胞放射敏感性。4个剂量(分别为2,4,6和8Gy)放射细胞。与对照细胞相比,在任何照射剂量时,H69AR GnT-V/1564或H69AR GnT-V/2224的细胞存活率显著减少(P<0.05)。这些结果表明下调GnT-V后小细胞肺癌的放射敏感性提高了。4.5下调GnT-V增强体内细胞的放射敏感性体内试验进一步研究GnT-V在肿瘤生长和放射敏感性上的效应。在BALB/c nu/nu鼠皮下接种1.0×107个细胞后,通过测量肿瘤大小评估H69AR, H69和H446的成瘤性。与相应的非放射组相比,放射组的小细胞肺癌细胞中的标化肿瘤体积都更小(P<0.05),但H69,H446细胞的减少程度比H69AR细胞更显著(P<0.05)。 H69AR细胞比H69和H446细胞对放射的敏感性低。放射后肿瘤体积均更小(P<0.05)。但H69AR GnT-V/1564或H69AR GnT-V/2224细胞比H69AR GnT-V/NC细胞的减少程度更显著(P<0.05)。结果表明下调GnT-V能提高H69AR在体内的放射敏感性。4.6抑制GnT-V增加放射诱导的G2-M期阻滞流式细胞仪评估小细胞肺癌的细胞周期差异。与相应的非放射组相比,放射组H69AR, H69和H446细胞在G2-M期比例增加(P<0.05),但H69或H446细胞较H69AR细胞增加程度更显著(P<0.05)。与相应的非放射组相比,放射组稳定转染GnT-V的H69AR细胞在G2-M期的比例都增加了(P<0.05),但H69AR GnT-V/1564或H69AR GnT-V/2224细胞与H69AR GnT-V/NC相比,增加程度更显著(P<0.05)。这一结果表明,抑制GnT-V增强放射引起的细胞周期进程中G2-M期阻滞。4.7GnT-V对放射诱导的凋亡和凋亡蛋白表达的影响本研究通过进行下述实验阐明GnT-V对放射诱导的细胞凋亡的影响：Hoechst33258染色,流式细胞术,TUNEL细胞凋亡原位检测和Caspase-3活性检测。Hoechst33258荧光染色法观察到在放射后小细胞肺癌细胞中出现染色质凝集、荧光染色增强及凋亡小体形成。H69或H446细胞较H69AR细胞放射诱导的细胞凋亡现象更明显。与H69AR GnT-V/NC相比,H69AR GnT-V/1564或H69AR GnT-V/2224放射后观察到更多的细胞凋亡。流式细胞仪检测小细胞肺癌细胞株在不同剂量(OGy、6Gy)射线放射后细胞的凋亡情况。细胞放射后凋亡均增加(P<0.05),然而增加程度不同。H69AR细胞比H69或H446细胞放射后的凋亡少,也少于H69AR GnT-V/1564和H69AR GnT-V/2224细胞(P<0.05)。与流式细胞仪检测结果一致,TUNEL染色显示与相应非放射组相比,放射组细胞凋亡率均增加了(P<0.05)。H69或H446细胞比H69AR细胞放射诱导更多的凋亡。H69AR GnT-V/1564或H69AR GnT-V/2224较H69AR GnT-V/NC放射后细胞凋亡率增加更显著。Caspase-3在凋亡的终末执行阶段有重要作用。与对应的非放射组相比,放射组H69AR.H69和H446细胞的Caspase-3活性分别增加了：(210.39±32.16)%,(499.93±42.74)%和(515.63±32.72)%(P<0.05). H69AR GnT-V/NC、H69AR GnT-V/1564和H69AR GnT-V/2224细胞在放射后Caspases-3活性分别增加(225.47±27.84)%,(595.09±38.63)%和(609.12±20.28)%(P<0.05)。这些结果均表明细胞在放射后Caspases-3活性显著增加。H69或H446细胞较H69AR细胞放射后Caspases-3活性增加更显著。H69AR GnT-V/1564或H69AR GnT-V/2224细胞与H69AR GnT-V/NC相比,Caspases-3活性放射后增加更显著。由于Bcl-2家族成员过度表达与放射耐受和凋亡相关,我们在体外和体内检测小细胞肺癌的Bcl-2、Bcl-xl和Bax在有或无放射时的表达水平。H69AR细胞较H69和H446细胞抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表达显著升高,促凋亡蛋白Bax略有下降。这些变化在放射后更明显(P<0.05)。为了进一步探讨在细胞放射敏感性的改变中GnT-V是否与Bcl-2家族密切相关,在体外和体内,放射或不放射转染的H69AR细胞后24小时,我们检测这些蛋白的表达。在H69AR GnT-V/1564或H69AR GnT-V/2224组,Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表达水平明显减少,而Bax略有增加,放射后的变化更明显(P<0.05)。但在H69AR GnT-V/NC组有或无放射没有显著差异。这些结果表明下调GnT-V可能通过抑制Bcl-2和Bcl-xl及增强Bax的表达提高H69AR的放射敏感性。4.8GnT-V对放射诱导的NF-кB信号通路的影响用NF-кB的荧光素酶报告基因研究小细胞肺癌细胞的NF-кB转录活性。共转染pNF-xB Luc报告质粒和pRL-CMV载体到小细胞肺癌细胞中,放射(OGy,6Gy)后24小时收集细胞,荧光光度计检测细胞中NF-кB的活性。根据研究结果,在小细胞肺癌细胞系H69AR, H69, H446和稳定转染GnT-V的H69AR GnT-V/NC, H69AR GnT-V/1564、H69AR GnT-V/2224中,放射诱导NF-кB活性的增加(分别为4.60,2.35,2.26倍和4.50,1.87,1.65倍)。结果显示在放射后,与H69和H446细胞相比,耐药H69AR细胞的荧光素酶活性的值更高,说明NF-кB被激活增多。在H69AR细胞中下调GnT-V后的H69AR GnT-V/1564、 H69AR GnT-V/2224细胞放射后的荧光素酶活性的值较H69AR GnT-V/NC明显减少,说明NF-кB的激活被抑制。结果表明在耐药细胞中下调GnT-V后可以降低放射诱导的NF-кB信号通路的激活。免疫荧光染色p65证实了上述结果。放射(OGy,6Gy)后24小时收集SCLC细胞,p65免疫荧光染色研究放射引起p65移位到细胞核的效应。放射后观察到p65易位到细胞核表明NF-кB被激活。结果显示H69AR细胞比H69和H446细胞放射诱导更多的p65核易位,NF-кB被激活多。与H69AR GnT-V/NC相比,在H69AR GnT-V/1564或H69AR GnT-V/2224细胞放射诱导的p65核易位减少,NF-кB活性被阻断。这与NF-кB的双荧光素酶报告基因检测的结果一致。五、结论1.人小细胞肺癌耐药细胞株H69AR具有多药耐药性和放射抵抗性。2.相对于小细胞肺癌细胞株H69和H446,小细胞肺癌多药耐药细胞株H69AR中GnT-V的水平显著增高,靶向GnT-V的shRNA真核表达质粒可以下调GnT-V的mRNA和蛋白表达。3.下调H69AR中GnT-V水平后,H69AR对化疗药和放射的敏感性显著增加,进一步证实了GnT-V有抵抗化疗药物和放射诱导细胞凋亡的作用,并且在小细胞肺癌对药物和放射耐受性产生过程中可能起到重要的作用。4.人小细胞肺癌耐药细胞株H69AR对药物和放射耐受性产生可能与G2-M期阻滞；GnT-V水平、NF-кB的活性和Caspase-3活性增高；Bcl-2家族中Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达增高及Bax蛋白表达降低有关。5. GnT-V可能是一个潜在的预测小细胞肺癌对放化疗敏感性的分子标记物。