哺乳动物耳蜗毛细胞为终末感觉细胞,一旦损伤便难以再生,利用潜在的内源性干细胞替代损伤毛细胞可能成为最有潜力的治疗策略。近年来,研究者们已经成功的从出生后早期的哺乳动物耳蜗中分离出具有干细胞功能的耳蜗前体细胞,并证实其在体外增殖,并可诱导分化成为毛细胞样细胞。然而耳蜗前体细胞并非真正意义上的干细胞,而是介于干细胞和终末细胞之间的一类细胞亚型,其增殖能力有限,随着细胞的有丝分裂而逐渐退出细胞周期。因此,如何维持耳蜗前体细胞的增殖能力成为研究的焦点。随着耳聋基础研究的深入,一些耳蜗发育相关的基因已被证实可以促进耳蜗前体细胞的增殖,在研究中我们检测了在SD大鼠耳蜗发育过程和体外培养的耳蜗前体细胞中TERT的表达变化,结果提示随着耳蜗的发育和耳蜗前体细胞增殖能力的降低TERT的表达逐渐降低。通过腺病毒转染技术将TERT转染进入体外培养的耳蜗前体细胞,证实过表达TERT可以促进耳蜗前体细胞的增殖,并初步证实Rb/E2F信号通路可能参与了TERT对耳蜗前体细胞增殖的调控。实验一新生SD大鼠耳蜗前体细胞的分离、培养目的:采用联合酶消化的方法建立新生大鼠耳蜗前体细胞的分离培养方法,以改善原有耳蜗前体细胞的分离、培养方法;方法:分离P1-P3 SD大鼠耳蜗基底膜,将基底膜分为四组,分别为:A组:嗜热菌蛋白酶消化组;B组:Ⅰ型胶原酶消化组;C组:嗜热菌蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化组;D组:嗜热菌蛋白酶消化+机械分离组。根据不同的分组进行酶消化和细胞分离,收集细胞进行悬浮培养和诱导分化,观察培养获得的细胞球数目,上皮细胞的纯度、细胞的增殖和定向分化能力。结果:从4种方法分离得到的细胞经培养后均可形成细胞球,表达干细胞标记物Nestin和细胞分裂标记物Brd U。经过诱导分化后基底膜上皮细胞可以分化成毛细胞样细胞和支持细胞,而间质细胞可以分化为神经元样细胞。采用嗜热菌蛋白酶和Ⅰ型胶原酶联合消化可以获得最多数量的细胞球,并证实这些细胞球为上皮来源,各组细胞的上皮细胞阳性率无显著差异。结论:采用嗜热菌蛋白酶和Ⅰ型胶原酶联合消化基底膜可以获得较高纯度的上皮细胞,显著提高耳蜗前体细胞的分离效率,该方法改善了原有耳蜗前体细胞的培养方法,为耳蜗前体细胞的研究提供了有力工具。实验二TERT在耳蜗发育过程中及耳蜗前体细胞增殖中的表达目的:TERT对于维持端粒酶活性具有关键作用,已被证实可以促进多种细胞的增殖,而其在内耳细胞中的作用并不清楚。该实验的目的是检测TERT在大鼠耳蜗发育过程中及耳蜗前体细胞培养过程中的表达变化。方法:我们采用分别RT-PCR和Western blot检测了TERT在P0,P3,P7,P14,P28SD大鼠耳蜗基底膜中的表达变化。同时分离培养大鼠耳蜗前体细胞,采用RT-PCR检测了在不同培养时间,不同细胞球类型及不同传代的前体细胞中nestin,PCNA结果:在出生后早期可以见到基底膜中有较低水平的TERT的表达,随着耳蜗发育其表达水平逐渐降低。体外培养的耳蜗前体细胞随着培养时间的延长,细胞传代,其nestin,PCNA及TERT的表达逐渐下降,镂空细胞球中TERT的表达水平显著低于混合性细胞球组及实性细胞球组。结论:TERT在出生后早期可有较低水平的表达,而随着耳蜗的发育其表达逐渐降低,提示TERT可能与耳蜗的发育有关。耳蜗前体细胞随着培养时间的延长及传代其增殖能力和干细胞特性降低,同时伴有TERT的表达下降,提示TERT可能与耳蜗前体细胞干细胞功能的维持有关。实验三Ad-TERT-EGFP的构建和大鼠耳蜗前体细胞的转染目的:构建携带目的基因为TERT的腺病毒载体,体外转染培养的大鼠耳蜗前体细胞,观察转染效率及细胞状态,确定适当的转染滴度。方法:1、构建复制缺陷重组腺病毒:Ad-TERT-EGFP及Ad-EGFP;2、应用不同感染复数的Ad-EGFP(MOI=250、200、150、100、50、25)转染耳蜗前体细胞,观察不同滴度转染时前体细胞形态的变化,荧光显微镜观察EGFP表达情况,确定转染MOI值,计算阳性细胞的转染率;3、应用RT-PCR、Western blot检测Ad-TERT-EGFP转染后耳蜗前体细胞中TERT的表达情况,用TRAP-ELISA检测转染后耳蜗前体细胞中端粒酶活性的变化。结果:收集病毒上清液经过鉴定,证实该重组腺病毒携带目的基因片段,病毒滴度为1×1011pfu/ml。在不同的感染复数下,EGFP的阳性细胞的比例随着MOI值增加而不断升高,当MOI值等于或者低于200时,病毒转染组与对照组细胞形态无明显差异。而当MOI>250时,病毒转染组细胞出现贴壁,生长抑制,坏死。确定本实验MOI值为200,转染后3-4天转染效果达到最佳,转染效率为32.15±3.12%。以MOI=200将Ad-TERT-EGFP转染耳蜗前体细胞,RT-PCR和Western blot检测耳蜗前体细胞中TERT m RNA和蛋白的表达显著升高,而端粒酶活性却没有显著变化。结论:应用腺病毒转染技术可以成功转染耳蜗前体细胞,转染后前体细胞中TERT的表达显著升高,为进一步研究TERT对耳蜗前体细胞增殖能力的影响奠定了基础。实验四过表达TERT对耳蜗前体细胞增殖能力的影响目的:通过携带TERT的腺病毒将TERT转染至体外培养的耳蜗前体细胞,观察过表达TERT后耳蜗前体细胞增殖能力的改变。方法:将耳蜗前体细胞分成三组:Ad-TERT-EGFP转染组;Ad-EGFP转染组;对照组,对各组细胞分别进行病毒转染,MOI=200,然后分别计数耳蜗前体细胞各类细胞球所占比例,MTT绘制生长曲线,Ed U染色、RT-PCR及Western blot检测前体细胞中PCNA的表达。结果:结果表明进行Ad-TERT-EGFP转染后7天,耳蜗前体细胞中实性细胞球所占比例比Ad-EGFP转染组及对照组显著升高(P<0.05),MTT结果也提示过表达TERT后,耳蜗前体细胞的增殖能力显著增强。Ed U染色提示Ad-TERT-EGFP转染组耳蜗前体细胞中Ed U阳性的细胞百分率显著高于Ad-EGFP组及对照组,RT-PCR和Western blot检测发现在Ad-TERT-EGFP转染组中PCNA的表达显著高于Ad-EGFP组及对照组。结论:过表达TERT可以促进耳蜗前体细胞的增殖。实验五TERT促进耳蜗前体细胞增殖的机制目的:研究转染Ad-TERT-EGFP耳蜗前体细胞后促进前体细胞增殖的可能机制。方法:应用RT-PCR检测Ad-TERT-EGFP转染组,Ad-EGFP转染组及对照组中P27KIP1、P53、Rb、E2F、β-catenin、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK2、CDK4、P16INK4a m RNA的表达水平变化,采用Western blot检测P27KIP1、P53、Rb、E2F、Cyclin D1、β-catenin蛋白的表达水平变化。结果:RT-PCR结果提示过表达TERT后,耳蜗前体细胞中P27KIP1、P53、P16INK4a表达水平较Ad-EGFP转染组及对照组显著降低(P<0.05),而CDK2、Cyclin D1的表达较Ad-EGFP转染组及对照组升高。Western blot结果提示:过表达TERT后耳蜗前体细胞中P27KIP1、P53、Rb蛋白的表达水平较Ad-EGFP转染组及对照组显著降低,而E2F及Cyclin D1表达升高。β-catenin蛋白在各组之间的表达无显著统计学差异。结论:过表达TERT可以促进耳蜗前体细胞增殖,其可能机制为通过调控Rb/E2F信号通路来促进耳蜗前体细胞的增殖。