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荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是我国南方重要的亚热带果树,种质资源丰富,果实色泽类型多样,但荔枝果实色泽生物合成的机理尚不清楚。荔枝果实的着色是花色素苷积累的结果,模式植物中的研究发现花色素苷的生物合成调控主要在转录水平,MYB-b HLH-WD40蛋白复合体调控着花色素苷生物合成途径。本文基于转录组和基因组数据库获得了可能参与荔枝花色素苷生物合成调控的MYB和b HLH转录因子,探讨了MYB和b HLH转录因子如何调控花色素苷生物合成途径,研究结果为揭示荔枝果皮花色素苷生物合成和调控的分子机制提供了理论依据。主要研究结果如下:1、通过农杆菌介导的烟草遗传转化研究了Lc MYB1转录因子的功能,结果表明,转Lc MYB1的烟草叶片和花梗积累花色素苷,而野生型烟草叶片和花梗不积累花色素苷。转基因烟草的花瓣中花色素苷含量的是野生型的3-4倍。烟草内源的b HLH转录因子Nt An1a和Nt An1b的表达在转基因烟草叶片和花梗中明显上调表达,这可能是叶片和花梗能合成花色素苷的重要原因。另外,烟草叶片中的Nt DFR、Nt ANS和Nt UFGT基因也显著上调表达,这些基因可能是Lc MYB1转录因子的靶基因。2、对荔枝果皮样品进行了RNA-seq测序,一共得到了4.6 G的原始数据,经过组装得到了51,089条Unigenes,这些Unigenes的平均长度为737 bp。大约70%(34,705)的基因序列可以通过比对公共数据库进行功能注释。此外,还对绿、黄和红果皮阶段的样品分别进行了数字表达谱测序。分析发现3,649个基因在发育过程中显著差异表达,其中156个基因在三个阶段中均显著差异表达。在荔枝果皮转录组中鉴定到了叶绿素降解和类黄酮合成的关键基因,其中SGR基因在荔枝果皮叶绿素降解过程中起着关键的作用。大多数花色素苷生物合成的结构基因的表达都随着果皮发育上升。通过比对鉴定发现了荔枝果皮中有53个MYB转录因子,预测了10个可能参与荔枝果皮类黄酮生物合成调控的MYB转录因子。3、在荔枝果皮转录组数据库中,发现了三个可能参与花色素苷生物合成调控的b HLH转录因子Lcb HLH1、Lcb HLH2和Lcb HLH3。系统进化树分析发现这个三个b HLH转录因子与其它植物中调控花色素生物合成的b HLH转录因子聚在一起。Lcb HLH3只定位于细胞核,Lcb HLH2定位于细胞质,Lcb HLH1则定位于细胞核和细胞质。Lcb HLH1和Lcb HLH3都能在细胞核中与Lc MYB1相互作用。尽管三个b HLH转录因子的表达与荔枝各个组织中的花色素苷含量无相关性,但Lcb HLH1或Lcb HLH3与Lc MYB1同时在烟草叶片中瞬时表达均比单独瞬时表达Lc MYB1积累更多的花色素苷,特别是Lcb HLH3。过表达Lc MYB1的烟草与过表达Lcb HLH3的烟草杂交后得到了同时超表达两个基因的烟草株系,该烟草株系叶片能积累大量的花色素苷,而单独过表达Lc MYB1的烟草叶片只能积累少量花色素苷,单独过表达Lcb HLH3时烟草叶片则不能积累花色素苷。共表达转基因烟草株系叶片中内源的b HLH转录因子Nt AN1a和Nt AN1b的表达显著上调,结构基因Nt DFR和Nt ANS也显著上调表达。双荧光报告实验表明,与单独表达Lc MYB1相比,Lc MYB1-Lcb HLH1或者Lc MYB1-Lcb HLH3同时表达能强烈激活Lc ANS的启动子活力,对Lc DFR启动子活性也有一定的促进作用。综上所述,Lcb HLH1和Lcb HLH3是Lc MYB1必要的相互作用因子,它们相互作用形成复合体调节花色素苷生物合成结构基因DFR和ANS的表达,进而促进花色素苷的生物合成。4、在荔枝转录组中还发现了两个可能与花色素苷生物合成调控相关的R2R3-MYB转录因子Lc MYB5和Lc MYB2。Lc MYB5在荔枝各个组织中均有表达且在荔枝果皮发育过程中表达变化不大。过表达Lc MYB5烟草花瓣和子房中的花色素苷含量显著高于野生型,同时内源的结构基因Nt CHI、Nt F3H、Nt DFR和b HLH调控基因Nt AN1a和Nt AN1b表达上调。转Lc MYB5烟草的花瓣、花丝、花药和子房积累了大量的花色素苷,其中花瓣中花色素苷的含量是野生型花瓣4-5倍。Lc MYB5定位于细胞核,能与花色素苷生物合成调控的Lcb HLH1转录因子相互作用。双报告基因实验证明Lc MYB5可以激活花色素苷生物合成结构基因F3H和DFR的启动子,推测Lc MYB5与Lcb HLH1转录因子互作,通过调控花色素苷生物合成结构基因启动子的活力调控花色素苷的生物合成。Lc MYB5不仅参与了花色素苷的生物合成途径,还参与了其它的一些生物过程,如转Lc MYB5的烟草花瓣及叶片的p H值降低,花瓣变大。5、Lc MYB2与Vv MYB5亚族聚在一起,它在荔枝的各个组织中均有表达,在荔枝果皮发育的早期表达量高。Lc MYB2在果皮发育中的表达模式与原花青素生物合成的关键基因Lc LAR和Lc ANR的表达一致。Lc MYB2定位于细胞核,能与Lcb HLH3相互作用。双荧光报告实验显示Lc MYB2与Lcb HLH3相互作用能激活原花青素生物合成基因Lc LAR和Lc ANR的启动子。推测Lc MYB2参与调控荔枝果皮中原花青素生物合成。转Lc MYB2烟草花药合成了少量花色素苷,说明Lc MYB2在某些特殊组织也参与了花色素苷的生物合成。此外,转Lc MYB2烟草的花药和花药中花粉的发育受到影响。