膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤,发病率逐年升高,已经严重威胁到人民的身体健康。2011年中国人膀胱恶性肿瘤发病率男性为0.38/万,女性为0.14/万。膀胱恶性肿瘤病理类型包括尿路上皮移行细胞癌、鳞状细胞癌和腺细胞癌等,其中,尿路上皮移行细胞癌最为常见,其病理类型占膀胱恶性肿瘤的90%以上,膀胱恶性肿瘤瘤体的大小、瘤体数量、淋巴结是否转移、分期与分级与其疾病进展密切相关,尤其是分期与分级,低分期、低分级膀胱恶性肿瘤出现疾病进展的风险要低于高分期、高分级膀胱恶性肿瘤。膀胱恶性肿瘤的分期(TMN)指肿瘤细胞浸润局部程度,肿瘤细胞远处转移和淋巴结转移情况,它是判断膀胱肿瘤预后的有重要价值的参数。临床上将膀胱恶性肿瘤分为非肌层浸润性和肌层浸润性膀胱恶性肿瘤,非肌层浸润性膀胱恶性肿瘤包括TMN分期为Tis原位癌,Ta非浸润性乳头状癌,T1肿瘤侵及上皮下结缔组织,肌层浸润性膀胱恶性肿瘤包括TMN分期T2(肿瘤侵犯肌层)及TMN T2以上分期的膀胱恶性肿瘤。膀胱恶性肿瘤细胞分级与肿瘤的复发和侵袭行为密切相关。膀胱恶性肿瘤的恶性程度以分级(Grade)表示。关于膀胱癌的分级,目前普遍采用WHO分级法(1973)分级法,分别用grade1、2、3或grade Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。对非肌层浸润期膀胱癌一般采用经尿道膀胱肿瘤切除术,对病理TMN分期为肌层浸润性期膀胱癌根治性膀胱切除术同期行盆腔淋巴结清扫术,是肌层浸润性膀胱癌的标准治疗,也是提高浸润性膀胱癌患者生存率、避免局部复发和远处转移的有效治疗方法。但是根治性膀胱切除术手术本身手术分离范围大、需要肠代膀胱或行尿流改道,对患者身体巨大打击,而且大约高达50%的患者会出现转移,5年生存率为36%～54%。对于T3-T4和(或)有淋巴结转移、远处转移膀胱恶性肿瘤高危患者,5年生存率仅为25%～35%。尽管机器人手术和腹腔镜手术的出现、相关手术器械的相继研发以及膀胱恶性肿瘤的全身或局部放、化疗治疗改进,但是膀胱恶性肿瘤仍然得不到根本治愈。膀胱镜检查和组织活检是诊断膀胱恶性肿瘤最可靠的方法。通过膀胱镜检查可以明确膀胱肿瘤的数量、肿块大小、生长形态(乳头状的或广基的)、生长部位以及癌肿周围膀胱粘膜的异常情况,同时可以对肿瘤和可疑病变进行活检以明确病理诊断。影像学检查可以明确恶性肿瘤局部浸润、远处转移等情况,用于膀胱癌术前分期。尿液细胞学检查往往特异性不高。虽然大部分尿液膀胱癌标记物显示出了较高的敏感性,但是其特异性却明显低于尿细胞学检查,迄今为止,仍无一种理想的膀胱癌标记物能够取代膀胱镜对膀胱恶性肿瘤的诊断、治疗。大部分膀胱恶性肿瘤患者确诊时处于中等分化膀胱癌恶性肿瘤的主要生物学特性是侵袭和转移,而这也是恶性肿瘤死亡的主要原因之一。肿瘤侵袭与转移过程非常复杂,尽管不同种类侵袭和转移特性有所不同,但是侵袭与转移过程的关键步骤基本相同。其中,侵袭指的是恶性肿瘤细胞侵犯和破坏周围正常组织,进入循环系统的过程。转移是指侵袭中细胞迁移到特定组织器官并发展成为继发性癌灶的过程。肿瘤的转移首先是肿瘤细胞从癌灶中分离脱落,然后再向周围组织侵袭。肿瘤转移关键一步必须穿透原发肿瘤周围的结缔组织才能进入循环系统,只有进入血液和(或)淋巴系统后癌细胞才能游走到远处组织、器官形成继发性肿瘤。从恶性肿瘤研究中癌细胞要实现侵袭和远处转移必要条件是癌细胞粘附锚定和癌细胞对细胞外基质屏障穿透。肿瘤细胞的侵袭过程涉及到基底膜的降解和穿透,肿瘤细胞穿过脉管后在结缔组织中移动。局部脉管基底膜损伤通常伴随肿瘤转移,而良性病变则无此改变。当肿瘤细胞和内皮粘附后,可暴露出细胞外基质,在基质金属水解酶等作用下水解细胞外基质,肿瘤细胞通过伪足的延伸实现细胞迁移的。基质金属酶通常分为三类包括间质胶原酶、间质溶解酶和明胶酶(Ⅳ型胶原酶),其中明胶酶除了能够水解纤连蛋白、弹力蛋白外,还可以降解明胶Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ型天然胶原。经研究证实恶性肿瘤细胞表面分子可以诱导成纤维细胞分泌出特殊蛋白水解酶是一类Zn2+依赖的基质金属蛋白酶MMPs(Matrix metalloproteinases).膀胱肿瘤分泌的Zn2+依赖的基质金属蛋白酶MMPs不仅参与降解基底膜屏障,实现恶性肿瘤细胞肌肉层局部转移侵犯,而且还可以促使机体生成血管内皮因子(VEGF),促进生成滋养恶性膀胱肿瘤组织的新生血管,促进肿瘤组织生长。大部分恶性肿瘤中基质金属蛋白酶MMPs主要来源于成纤维细胞,正常机体中成纤维细胞也会产生基质金属蛋白酶MMPs,产生的量极少。而恶性肿瘤组织其肿瘤细胞会分泌一些刺激因子,刺激肿瘤组织附近的成纤维细胞产生大量的基质金属蛋白酶MMPs.这些刺激因子近来已经在世界各不同实验室被证实,其中存在于恶性肿瘤细胞表面的一种粘附分子EMNPRIN(extracellular matix matelloproteinase inducer, CD147),最早从一种肺癌细胞系中被提取出来,后在发现不同种属生物中有CD147同源分子。CD147(or extracellular matix matelloproteinase inducer,EMNPRIN),是一个肿瘤表面的基质蛋白酶诱导因子,其结构上其是一种广泛表达于人体多种组织的单次跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族(IgSF),不仅在多种肿瘤细胞和组织中高表达,同时与炎症反应如类风湿性关节炎、心血管疾病和精子分化有关。实验结果显示：CD147的表达水平与多种恶性肿瘤组织内成纤维细胞的基质金属蛋白酶MMPs表达密切相关。EMNPRIN的作用不仅局限于肿瘤-成纤维细胞、肿瘤-内皮细胞的相互作用,EMNPRIN可以刺激肿瘤细胞本身自分泌产生MMPs,尤其是MMPs-2的分泌增加。同时还可以通过旁分泌的方式调节内皮细胞产生的MMPs诱导肿瘤组织滋养血管生成,促进肿瘤组织生长。MMPs对肿瘤血管生成也起着重要作用。MMPs对内皮细胞本身就有多方面作用,其对于内皮细胞的迁移和管腔形成是必要的。在肿瘤血管形成过程中,MMP-2和MMP-9对于肿瘤起始血管的形成起到开关作用,在血管形成过程的肿瘤组织内,MMP-2和MMP-9的表达比无血管的肿瘤中某些增高。几乎在所有肿瘤组织中均有MMP-2和MMP-9的过量表达,尤其是肿瘤细胞本身、间质成纤维细胞或侵润型的炎性细胞所产生的MMP-2和MMP-9与肿瘤的侵袭和转移能力密切相关,并且提示着较差的预后。肿瘤细胞中的MMPs,尤其是MMP-2和MMP-9等高表达与肿瘤的侵袭、转移能力和复发的高风险密切相关。在肿瘤的转移过程中值得注意的是,加入循环系统的肿瘤细胞到达新的转移灶之前必须逃避免疫细胞识别和清除。有研究表明MMP通过促进肿瘤细胞与血小板之间的相互作用,从而抑制循环系统中免疫细胞。因此大量研究显示了MMP与肿瘤侵袭、转移之间密切联系.实验研究表明单独使用MMPs抑制剂治疗肿瘤效果不佳,而研究学者对黑色素瘤系等体外研究表明,使用相应的抗体可以显著降低恶性肿瘤细胞侵袭力。实验结果提示如果以CD147为治疗靶标的方向努力有可能找到一种有效的恶性肿瘤治疗方式。RNA干扰现象(RNA interfering, RNAi)指的是将双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)导入细胞后,可引起与其同源mRNA发生高效、特异性降解,从而导致相应的基因沉默现象。由于发生在转录后水平,因此又称转录后基因沉默。但因为大片段的dsRNA在哺乳动物细胞内可导致广泛非特异性地基因沉默使用受到限制。人工合成的21-23nt大小的小片段dsRNA导入培养的哺乳动物细胞后不会引起非特异性的基因沉默,可序列特异性地封闭特定基因表达,成为RNA干扰在哺乳动物中应用的标志性事件。21-23nt大小双链dsRNA片段故称为干扰性小RNA(small imerfenng RNA, siRNA),可以特异性降解mRNA,封闭特定基因表达。其具有与基因敲除相媲美的功能,技术操作快捷简单,高效而稳定,成为近年来一种研究基因功能的新方法。本课题主要内容是拟以RNAi基本原理,探讨CD147shRNA干扰降解CD147mRNA封闭其表达可能性并验证其对膀胱肿瘤细胞生物学行为影响。人体肿瘤细胞属于哺乳动物真核细胞,不能直接将shRNA注入细胞,需要一定介质也就是RNA干扰载体运输到细胞核内产生早期事件。为达到序列特异性触发同源单链RNA (CD147RNA)的目的,课设计一种人工合成的短发夹ShRNA,通过诱导靶标mRNA的断裂和降解而诱发RNA干扰,显著下调了CD147基因表达水平。理想的载体是对介入方相互不产生毒害,反应迅速,表达可控而且无表达泄露。获得介质的方法较多,质粒、反转录病毒、脂质体、腺病毒、慢病毒等。腺病毒主要是通过柯萨奇病毒/腺病毒受体进入靶细胞的,与柯萨奇病毒/腺病毒受体结合后,腺病毒通过整合素介导的内吞而内化的,之后主动转运到细胞核内,一旦进入核内便启动了早期事件,随后腺病毒晚期基因表达,病毒复制。腺病毒颗粒能长时间保存,因此在腺病毒生产后很长一段时间内均可进行相关实验。基于腺病毒体系的优点有设计shRNA,降低脱靶效应、订购shRNAs引物,转染操作,能维持较长时间的基因沉默,适用于长期的干扰研究。本课题采用的腺病毒作为载体。通过cDNA库寻找到CD147mRNA长单链,筛选出合适的CD147-siRNA靶序列及来源,通过设计发卡CD147-siRNA,成功构建出CD147的siRNA重组腺病毒颗粒用于感染细胞。不同的病毒对不同细胞和组织有不同的感染效率,而且需要验证RNAi表达效果,我们再通过RT-PCR和Western Bolt实验来验证mRNA降解和表达情况。确定干扰效果后再通过观察对封闭CD147表达后的离体膀胱癌恶性细胞侵袭性生物学改变,来阐明CD147对膀胱恶性肿瘤细胞侵润的影响,为研究膀胱恶性肿瘤更有效的治疗手段提供新的思路。一、实验材料和方法主要的实验材料1、选取赣南医学院附属第一医院泌尿外科2011年9月至2014年2月76例病理类型为移行上皮癌膀胱癌手术患者,取16例癌旁正常组织制作成膀胱癌组织芯片。其中男性62例,女性14例,所有患者术前均未行放、化疗等辅助治疗,肿瘤均为单发。其中男性为62例,女性为9例,年龄22-75岁,中位数年龄57岁。术后病理组织学分级依据世界卫生组织(WHO)1999年发布的尿路上皮癌分类标准：G112例,G225例,G339例。临床病理分期按照国际抗癌联盟(UICC)中TNM标准：T1期28例,T222例,T320例,T46例。2、人膀胱癌细胞株由购自中国科学院上海细胞研究所。3、针对CD147的siRNA重组腺病毒表达载体和阴性对照腺病毒颗粒由上海吉玛生物技术有限公司协助合成。重要的实验方法1、免疫组化方法检测CD147在病理不同分期、分级膀胱癌组织和癌旁正常组织中的表达情况,分析出CD147在正常的膀胱组织和膀胱癌组织中表达是否存在差异,CD147在膀胱癌组织中的表达与膀胱癌不同病理分期、分级之间关系。2、设计CD147shRNA的靶序列及其来源,协助构建针对CD147siRNA重组腺病毒(Ad-CD147siRNA)载体和阴性对照组腺病毒颗粒.利用CD147siRNA重组腺病毒转染膀胱癌细胞确定转染是否成功并确定适宜的MOI值。RT-PCR检测验证CD147siRNA干扰导致mRNA下调,Western Blot检测CD147siRNA干扰mRNA沉默其相应基因蛋白表达,判断CD147siRNA干扰效果。为下一步研究CD147基因RNAi对人膀胱癌细胞作用奠定基础。3、用CD147基因siRNA重组腺病毒(Ad-CD147siRNA)干扰组和空载腺病毒对照组分别转染人膀胱恶性肿瘤细胞。分别用MTT检测CD147siRNA对膀胱肿瘤恶性细胞增殖活性的影响,划痕试验检测Ad-CD147siRNA对膀胱肿瘤细胞迁移能力的影响,明胶酶谱实验检测膀胱癌细胞感染干扰组腺病毒后MMP-2、MMP-9的分泌变化,Transwell、室法检测膀胱恶性肿瘤细胞侵袭能力改变,ELISA法检测膀胱恶性肿瘤细胞腺病毒感染后VEGF分泌水平变化。二、实验结果1、CD147在正常膀胱组织中表达弱或无表达,而在膀胱恶性肿瘤组织中(弱-强)阳表达率为75.0%(57/76), CD147免疫组化染色区域主要发生在膀胱癌细胞膜结构附近,在膀胱恶性肿瘤细胞中CD147存在过度表达。通过采集不同TMN分期、不同分级膀胱恶性肿瘤癌细胞进行免疫组化着色试验结果显示,CD147表达与膀胱恶性肿瘤TMN分期(P=0.005)、分级(P=0.047)相关,而与年龄(P=0.593)、性别(P=0.880)无关。说明膀胱恶性肿瘤细胞中不仅有CD147表达,并且其表达程度与膀胱恶性肿瘤的恶性程度(分级)和侵袭力(分期)相关。2、构建出针对CD147基因的siRNA重组腺病毒(Ad-CD147siRNA),确定适宜的腺病毒感染率(MOI),半定量RT-PCR和Western Blot实验验证CD147mRNA下调和基因沉默蛋白表达效果。结果显示CD147mRNA及其相应的蛋白表达干扰组和空白组、对照组存在明显差异(P<0.01)。CD147siRNA可以高效而特异地干扰膀胱恶性肿瘤细胞CD147mRNA,并造成mRNA降解和相应蛋白表达水平下降。上述试验为进一步研究CD147siRNA对离体膀胱恶性肿瘤细胞生物学作用影响奠定基础。3、实验检测siRNA干扰后离体膀胱恶性肿瘤细胞生物学行为变化。MTT实验结果表明,CD147siRNA/Ad感染肿瘤细胞72小时、96小时和120小时后,细胞增殖能例显著下降,其下降率分别为38%,41%和43%(P<0.01)。细胞划痕试验中,CD147siRNA载体腺病毒感染人膀胱肿瘤细胞后,空白带两侧细胞迁移能力明显下降,干扰组和空白组、对照组细胞移动距离分别为0.76mmm和1.73mm、1.83mm (P<0.01),明胶酶谱实验结果发现,与对照组相比,CD147siRNA/Ad干扰组肿瘤细胞的MMP-2、MMP-9分泌量分别下降了60.8%和41.3%(P<0.01)。侵袭实验结果显示,CD147siRNA/Ad感染后,膀胱肿瘤细胞侵袭能力较对照组和未感染组分别下降了73.8%和70.9%(P<0.01)。ELISA结果发现,与对照组相比,CD147siRNA/Ad干扰组显著下降了蛋白表达水平,其下降率分别为52.5%(P<0.01)。三、实验结论1、CD147基因在正常膀胱组织中表达较弱或无表达,在膀胱恶性肿瘤组织中存在过度表达,其表达强度与膀胱恶性肿瘤的分期、分级相关,CD147可作为判断膀胱肿瘤是否具备侵袭力的指标。2、CD147基因siRNA载体腺病毒可成功转染离体人膀胱肿瘤细胞,选择腺病毒作为基因载体,siRNA干扰可维持较长时间基因沉默。siRNA效应分析经RT-PCR和Western-Blot检测,CD147分子在RNA水平和相应的蛋白水平被干扰。3、对siRNA干扰后离体膀胱肿瘤细胞生物学行为实验结果显示：CD147siRNA通过RNAi干扰机制降解mRNA并沉默其基因表达,抑制膀胱恶性肿瘤细胞生物学行为。