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自噬是存在于真核细胞中普遍的生命现象,是近十年来生命科学领域一个新的研究热点,在降解胞内蛋白、蛋白质结构重建、清除废物、保持细胞内环境稳定等方面发挥着非常重要的作用。自噬对于降解错误折叠和聚集蛋白方面起着关键的作用,与神经变性疾病关系密切,受到越来越多研究者的关注。本课题以SMS2基因敲除(SMS2-/-)小鼠为研究对象,应用MAPLC3和Beclin-1免疫细胞化学,PCR、电镜和Western blotting等技术方法,以期探讨SMS2基因敲除小鼠海马神经细胞内一种重要的调节细胞凋亡的第二信使-神经酰胺增多后,对于神经细胞自噬现象的影响,为通过诱导自噬治疗神经变性疾病提供临床治疗依据。为了研究SMS2基因敲除小鼠海马神经细胞内神经酰胺增多后,对于神经细胞自噬现象的影响,本实验室从美国纽约州立大学动物实验中心引进的SMS2基因敲除小鼠的杂合子SMS2+/-小鼠为种鼠,利用PCR方法鉴定培育出的SMS2-/-小鼠为模型,探讨神经酰胺对神经细胞自噬的影响,从而为神经变性疾病的临床治疗和和预防提供理论依据。目的:利用SMS2基因敲除小鼠探讨神经酰胺对海马神经细胞自噬现象的影响,从而为神经变性疾病的临床治疗和和预防提供理论依据。方法:利用从美国纽约州立大学动物实验中心引进的SMS2+/-小鼠(雄性一只,雌性两只,背景为C57BL/6J小鼠)为种鼠,将杂合子SMS2+/-小鼠采用杂交、回交、互交的方法进行繁殖,用酚氯仿提取法提取小鼠基因组DNA, PCR扩增目的基因,琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型做出鉴定,获得雄性和雌性纯合子SMS2-/-小鼠,按照同样方法进行繁殖;以SMS2-/-小鼠为研究对象,野生型(WT)小鼠为对照组,利用透射电子显微镜观察P14和P30模型组与对照组海马神经细胞中自噬和自噬溶酶体结构;利用免疫荧光染色技术观察P7、P14和P30模型组和对照组神经细胞自噬细胞数,并观察Beclin-1与MAPLC3免疫细胞化学染色在神经细胞的共表达情况;利用Western blotting方法检测P14和P30模型组与对照组小鼠海马CA1区神经细胞MAPLC3的蛋白水平;采用单因素方差分析LSD检验对数据进行分析。结果: 1. SMS2-/-小鼠海马CA1区神经细胞自噬现象:①电子显微镜下,SMS2-/-小鼠较WT小鼠海马神经细胞内出现较多自噬体或自噬溶酶体样结构;②光镜下,SMS2-/-小鼠P7、P14和P30 CA1区神经细胞自噬细胞数较WT小鼠高,变化有显著差异(P﹤0.01)。2. Beclin-1对于自噬的调节作用:①Beclin-1在SMS2-/-小鼠与WT小鼠的表达情况比较与MAPLC3基本一致,P7、P14和P30 SMS2-/-小鼠Beclin-1阳性细胞数明显多于对照组(P<0.01)。②Beclin-1与MAPLC3二者在同一细胞中基本呈重叠表达3.利用Western blotting检测P14和P30 SMS2-/-小鼠和WT小鼠海马CA1区神经细胞MAPLC3蛋白的相对表达量,SMS2-/-小鼠较WT小鼠高,变化有显著差异(P﹤0.01)。结论:SMS2-/-小鼠海马神经细胞内神经酰胺增多,神经酰胺不仅促进细胞的凋亡,同时促进自噬,造成小鼠海马神经细胞自噬现象增强。