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研究背景三氯乙烯（Trichloroethylene,TCE）,分子式为C2HCl3,沸点86.7℃,是工业上常用卤代烃类化合物,为无色透明液体、难溶于水,可以与多种有机溶剂混溶。由于其溶解能力较强,通常在工业生产中用作金属洗涤剂、冰箱制冷剂、杀虫剂和萃取剂,同时也是一种常见的化工原料,在工业上具有广泛的应用。部分工人长期接触三氯乙烯会对机体产生健康损害作用,可产生药物过敏样的严重全身皮肤反应,可产生发热等症状,同时还可伴随有一些脏器的损伤,有的病人发病时间短,病情严重,严重者甚至导致多器官功能衰竭继而死亡,包括急性、慢性和亚急性作用。职业性三氯乙烯药疹样皮炎（ODMLT）是一种全身性变应性疾病,主要是以急性皮肤炎症性反应为主要表现的,同时伴有多脏器的损伤。相当一部分工人接触TCE后会发生ODMLT,该疾病病死率较高,病情发展快,给广大的职业接触工人带来了相当程度的健康危害,其中肝脏损害是导致死亡的重要原因之一。为什么ODMLT的危害如此严重,有研究发现,除了迟发型IV型变态反应参与外,补体系统在疾病的发生以及发展过程中起到了重要作用,补体C3在受损肝脏中有大量沉积。课题组前期研究发现提示,多种细胞内含有组织蛋白酶L（cathepsin L,CTSL）,细胞内的C3a和C3b主要通过组织蛋白酶L的介导而产生的,使细胞内补体激活,从而产生相应的生物学效应。研究目的通过建立成熟的TCE致敏BALB/C小鼠模型,利用组织蛋白酶L抑制剂和枯否氏细胞抑制剂干预细胞内补体的活化,对不同组别小鼠的皮肤致敏情况、肝脏补体C3、组织蛋白酶L、肝功能指标以及肝脏病理切片的观察,探讨组织蛋白酶L介导的肝脏细胞内补体激活在三氯乙烯致小鼠免疫性肝脏损伤中的作用,为职业性三氯乙烯药疹样皮炎所致脏器损伤的防治提供新思路。研究方法实验选用130只雌性无特定病原体级（Specific pathogen free,SPF）BALB/c小鼠,按照随机化的原则,把BALB/c小鼠分为溶剂对照组、空白对照组、三氯乙烯处理组、组织蛋白酶L抑制剂致敏模型处理组、三氯乙烯+三氯化钆(GdCl3)抑制剂联合处理组（后称GdCl3抑制剂处理组）,每个组别根据情况又分为3组,按照课题组前期已成功建立的三氯乙烯小鼠致敏模型方法建模,并在末次激发后24h,72h和7d分别处死相应组别的动物,收集相应生物样本。观察小鼠皮肤致敏情况,显微镜下观察小鼠肝组织病理切片,使用谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）试剂盒检测血清ALT和AST水平,免疫组化检测肝脏补体以及组织蛋白酶L的表达情况,荧光检测肝细胞上C3以及组织蛋白酶L,实时定量PCR检测肝脏补体C3和组织蛋白酶基因表达情况。研究结果1.小鼠致敏情况在本次致敏实验中,小鼠致敏模型TCE处理组的致敏率为32.6%;组织蛋白酶L抑制剂处理组小鼠致敏率为30.4%,三氯化钆抑制剂处理组小鼠致敏率为28.3%,其中空白对照组和溶剂对照组小鼠皮肤均未出现红斑、水肿等明显异常。肝脏HE染色显示,三氯乙烯致敏组中小鼠肝脏的局部区域出现了细胞水肿;三氯乙烯+三氯化钆抑制剂致敏组小鼠肝脏细胞水肿明显减少,损伤减弱。2.肝脏解剖学外观评价和脏器系数比较空白对照组和溶剂对照组肝脏未发现明显异常病变。TCE非致敏组肝脏也未见明显异常。各组别中TCE致敏阳性组肝脏肿大,脏器系数显著高于空白和溶剂对照组（P<0.05）。3.肝功能检测结果经检测,空白组,溶剂对照组以及各组别的未致敏组的ALT和AST相比,差异都无统计学意义,各组别三氯乙烯致敏阳性组24小时、72小时和7天组ALT、AST和对照组相比均升高（P<0.05）,但升高幅度有所不同,经三氯化钆抑制剂和组织蛋白酶L抑制剂处理后的各致敏组动物的ALT和AST的指标均升高,但是升高的幅度有所减小,但仍然有差异（P<0.05）,在致敏后72小时损伤达到最高峰,随后指标会逐渐向正常值恢复。4.肝脏组织中C3的表达情况免疫组化结果显示,C3在各个组别的TCE致敏组中均有表达,但主要表达在TCE致敏阳性72h组的肝脏中,这和肝功能的趋势一致,在CTSL抑制剂致敏阳性72h组表达量下降;在GdCl3处理组72h阳性组表达量亦下降,通过免疫荧光检测显示,在处理组中,C3主要表达在TCE致敏72h组,CTSL抑制剂致敏阳性72h组C3表达下降,GdCl3处理组致敏组的C3表达也下降,而其他各组C3的表达均不明显;5.肝脏中CTSL的表达情况通过免疫荧光检测显示,CTSL在各组肝脏均有表达,但表达量各组之间差异明显,其中CTSL在TCE致敏阳性72h组和空白组以及溶剂组相比表达明显升高,而在组织蛋白酶L抑制剂组CTSL的表达明显降低,同时,CTSL在GdCl3处理组明显降低;通过免疫组化方法检测发现,CTSL在各组肝脏均有所表达,其中CTSL在TCE致敏阳性72h组和空白组以及溶剂组相比表达明显升高,而在CTSL抑制剂组CTSL的表达明显降低,同时在GdCl3处理组发现,CTSL的表达也明显降低。6.肝脏组织中CTSLmRNA的表达情况与空白对照组相比,三氯乙烯致敏阳性24小时和72h小时组、7天组组织蛋白酶LmRNA表达水平升高明显（P<0.05）;三氯化钆抑制剂处理组和组织蛋白酶L抑制剂处理组的致敏阳性动物的指标和对应的非抑制剂组阳性相比有下降（P<0.05）,每个处理组的未致敏组CTSLmRNA与空白组和溶剂对照组相比,差异均无统计学意义（P>0.05）。7.肝脏病理学在各组别的非致敏组肝脏未见病理学损伤,肝细胞结构正常。TCE致敏24 h组和72 h组肝脏发生病变,常见气球样变性,72 h组更为严重,可出现肝细胞变性、坏死和炎细胞浸润,肝细胞发生气球样变性,TCE+CTSL抑制剂致敏组和TCE+GdCl3抑制剂处理组小鼠肝脏细胞水肿明显减少,损伤减弱。TCE致敏7 d组肝脏组织逐渐恢复正常。结论1.一定剂量的TCE可以致敏小鼠,本次实验致敏率为32.6%;2.小鼠细胞内补体激活参与了肝损伤并发挥重要作用;3.腹腔注射CTSL抑制剂和GdCl3可显著减轻TCE致敏诱导的肝脏损伤;4.在TCE所致BALB/c小鼠免疫性肝损伤中,CTSL可能介导了肝脏细胞内补体激活;5.CTSL可以调节肝脏补体活化,对TCE所致免疫性肝损伤发挥重要作用;6.肝脏枯否氏细胞内的补体活化可能是导致肝损伤的重要原因,为选择靶向药物进行临床治疗提供新思路。